Volledige lengte mRNA-sequencing-Nanopore
Servicevoordelen
● Lage sequentiebias
● Onthulling van cDNA-moleculen met de volledige lengte
● Minder gegevens vereist voor hetzelfde aantal transcripties
● Identificatie van meerdere isovormen per gen
● Expressiekwantificering op isovormniveau
Servicespecificaties
| Bibliotheek | Platform | Aanbevolen dataopbrengst (Gb) | Kwaliteitscontrole |
| cDNA-PCR (poly-A verrijkt) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/monster (afhankelijk van soort) | Verhouding over de volledige lengte> 70% Gemiddelde kwaliteitsscore: Q10
|
Bio-informatica analyses
●Verwerking van ruwe gegevens
● Transcriptie-identificatie
● Alternatieve splitsing
● Expressiekwantificering op genniveau en isovormniveau
● Differentiële expressieanalyse
● Functieannotatie en verrijking (DEG's en DET's)
Monstervereisten en levering
Voorbeeldvereisten:
Nucleotiden:
| Conc. (ng/μl) | Hoeveelheid (μg) | Puurheid | Integriteit |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Beperkte of geen eiwit- of DNA-verontreiniging weergegeven op de gel. | Voor planten: RIN≥7,0; Voor dieren: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; beperkte of geen basislijnhoogte |
Weefsel: Gewicht (droog): ≥1 g
*Voor weefsel kleiner dan 5 mg raden wij aan om snel ingevroren (in vloeibare stikstof) weefselmonsters op te sturen.
Celsuspensie: celgetal = 3×106- 1×107
*Wij raden aan om bevroren cellysaat te verzenden.In het geval dat het aantal cellen kleiner is dan 5×105wordt snel ingevroren in vloeibare stikstof aanbevolen, wat de voorkeur heeft voor micro-extractie.
Bloedmonsters: Volume≥1 ml
Aanbevolen monsterlevering
Verpakking: centrifugebuisje van 2 ml (aluminiumfolie wordt niet aanbevolen)
Monsterlabeling: groeperen+repliceren, bijvoorbeeld A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Verzending: 2. Droogijs: monsters moeten in zakken worden verpakt en in droogijs worden begraven.
- RNAstable-buizen: RNA-monsters kunnen worden gedroogd in een RNA-stabilisatiebuis (bijv. RNAstable®) en bij kamertemperatuur worden verzonden.
Servicewerkstroom
Nucleotiden:
Levering van monsters
Bouw van bibliotheek
Volgorde aanbrengen in
Gegevensanalyse
After-sales diensten
Servicewerkstroom
Zakdoek:
Experimentontwerp
Levering van monsters
RNA-extractie
Bouw van bibliotheek
Volgorde aanbrengen in
Gegevensanalyse
After-sales diensten
1.Differentiële expressieanalyse - Vulkaanplot
Differentiële expressieanalyse kan worden verwerkt op zowel genniveau om differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) te identificeren als op isovormniveau om differentieel te identificeren
uitgedrukte transcripties (DET's)
2.Hiërarchische clustering-heatmap
3. Alternatieve splitsingsidentificatie en classificatie
Astalavista kan vijf soorten alternatieve splitsingsgebeurtenissen voorspellen.
4.Alternatieve identificatie van poly-adenylatie (APA) gebeurtenissen en motief op 50 bp stroomopwaarts van poly-A
BMK-zaak
Alternatieve splitsingsidentificatie en kwantificering op isovormniveau door transcriptoomsequencing over de volledige lengte van nanoporiën
Gepubliceerd:Natuurcommunicatie, 2020
Sequentiestrategie:
Groepering: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (K700E-mutatie);3. Normale B-cellen
Sequentiestrategie: MinION 2D-bibliotheeksequencing, PromethION 1D-bibliotheeksequencing;Short-read-gegevens van dezelfde monsters
Sequentieplatform: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Belangrijkste resultaten
1. Alternatieve splitsingsidentificatie op isovormniveau
Lang gelezen sequenties maken de identificatie van mutant SF3B1 mogelijkK700E-veranderde splitsingsplaatsen op isovormniveau.35 alternatieve 3'SS's en 10 alternatieve 5'SS's bleken significant verschillend gesplitst te zijn tussen SF3B1K700Een SF3B1WT.33 van de 35 wijzigingen werden nieuw ontdekt door lang gelezen sequenties.
2. Kwantificering van alternatieve splicing op isovormniveau
Expressie van intronretentie (IR) isovormen in SF3B1K700Een SF3B1WTwerden gekwantificeerd op basis van nanoporiesequenties, wat een wereldwijde neerwaartse regulatie van IR-isovormen in SF3B1 onthuldeK700E.
Referentie
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Volledige transcriptkarakterisering van de SF3B1-mutatie bij chronische lymfatische leukemie onthult downregulatie van vastgehouden introns [J].Natuurcommunicatie.
