Producten

mRNA-sequencing over de volledige lengte -PacBio

De nieuwevolledige transcriptoomsequencing, ook bekend alsDe nieuweIso-Seq maakt gebruik van de voordelen van de PacBio-sequencer wat betreft leeslengte, waardoor cDNA-moleculen met de volledige lengte kunnen worden gesequenced zonder onderbrekingen.Dit vermijdt volledig eventuele fouten die worden gegenereerd in de stappen voor het samenstellen van transcripties en construeert unigene-sets met resolutie op isovormniveau.Deze unigene-sets bieden krachtige genetische informatie als ‘referentiegenoom’ op transcriptoomniveau.Bovendien maakt deze service, in combinatie met sequencinggegevens van de volgende generatie, een nauwkeurige kwantificering van expressie op isovormniveau mogelijk.

Platform: PacBio vervolg II

Bibliotheek: SMRT-belbibliotheek

Neem contact met ons op

Servicedetails

Demoresultaten

Casestudy

Servicevoordelen

● Directe uitlezing van cDNA-molecuul met de volledige lengte van het 3'-uiteinde tot het 5'-uiteinde

● Iso-vormniveauresolutie in sequentiestructuur

● Afschriften met hoge nauwkeurigheid en integriteit

● Zeer compatibel met dampsoorten

● Grote sequencingcapaciteit met 4 PacBio Sequel II-sequencingplatforms uitgerust

● Zeer ervaren met meer dan 700 Pacbio-gebaseerde RNA-sequencingprojecten

● Op BMKCloud gebaseerde resultaatlevering: op maat gemaakte datamining beschikbaar op het platform.

● After-sales services geldig gedurende 3 maanden na voltooiing van het project

Servicespecificaties

Platform: PacBio vervolg II

Sequentiebibliotheek: Poly A-verrijkte mRNA-bibliotheek

Aanbevolen dataopbrengst: 20 Gb/monster (afhankelijk van soort)

FLNC (%): ≥75%

*FLNC: niet-chimere transcripten van volledige lengte

Bio-informatica analyses

● Verwerking van ruwe gegevens

● Transcriptie-identificatie

● Sequentiestructuur

● Kwantificering van expressies

● Functieannotatie

Monstervereisten en levering

Voorbeeldvereisten:

Nucleotiden:

Conc. (ng/μl)

Hoeveelheid (μg)

Puurheid

Integriteit

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Beperkte of geen eiwit- of DNA-verontreiniging weergegeven op de gel.

Voor planten: RIN≥7,5;

Voor dieren: RIN≥8,0;

5,0≥ 28S/18S≥1,0;

beperkte of geen basislijnhoogte

Weefsel: Gewicht (droog):≥1 gram
*Voor weefsel kleiner dan 5 mg raden wij aan om snel ingevroren (in vloeibare stikstof) weefselmonsters op te sturen.

Celsuspensie:Aantal cellen = 3×10⁶- 1×10⁷
*Wij raden aan om bevroren cellysaat te verzenden.In het geval dat het aantal cellen kleiner is dan 5×10⁵wordt snel ingevroren in vloeibare stikstof aanbevolen, wat de voorkeur heeft voor micro-extractie.

Bloedstalen:Volume≥1 ml

Micro-organisme:Massa ≥ 1 g

Aanbevolen monsterlevering

Houder:
Centrifugeerbuisje van 2 ml (aluminiumfolie wordt niet aanbevolen)
Monsterlabeling: groeperen+repliceren, bijvoorbeeld A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Verzending:

1. Droogijs: Monsters moeten in zakken worden verpakt en in droogijs worden begraven.
2. RNAstable buizen: RNA-monsters kunnen worden gedroogd in een RNA-stabilisatiebuis (bijv. RNAstable®) en bij kamertemperatuur worden verzonden.

Servicewerkstroom

Experimentontwerp

Levering van monsters

RNA-extractie

Bouw van bibliotheek

Volgorde aanbrengen in

Gegevensanalyse

After-sales diensten

Vorig: Eukaryote mRNA-sequencing-Illumina

Volgende: Volledige lengte mRNA-sequencing-Nanopore

1.FLNC-lengteverdeling

De lengte van niet-chimere read (FLNC) met de volledige lengte geeft de lengte van cDNA in bibliotheekconstructie aan.FLNC-lengteverdeling is een cruciale indicator bij het evalueren van de kwaliteit van de bibliotheekconstructie.

mRNA-FLNC-leeslengteverdeling

FLNC-leeslengteverdeling

2. Volledige verdeling van de lengte van het ORF-gebied

We gebruiken TransDecoder om eiwitcoderende regio's en overeenkomstige aminozuursequenties te voorspellen om unigene sets te genereren, die volledige niet-redundante transcriptinformatie in alle monsters bevat.

mRNA-volledige ORF-lengteverdeling

Volledige lengteverdeling van het ORF-gebied

3.KEGG-routeverrijkingsanalyse

Differentieel tot expressie gebrachte transcripten (DET's) kunnen worden geïdentificeerd door op NGS gebaseerde RNA-sequencinggegevens uit te lijnen met transcriptsets van volledige lengte die zijn gegenereerd door PacBio-sequencinggegevens.Deze DET's kunnen verder worden verwerkt voor verschillende functionele analyses, bijvoorbeeld KEGG-routeverrijkingsanalyse.

mRNA-DEG-KEGG-pathway-verrijking

DET KEGG-routeverrijking - Puntdiagram

BMK-zaak

De ontwikkelingsdynamiek van het Populus-stamtranscriptoom

Gepubliceerd: Tijdschrift voor plantenbiotechnologie, 2019

Sequentiestrategie:
Monsterverzameling:stamgebieden: top, eerste internode (IN1), tweede internode (IN2), derde internode (IN3), internode (IN4) en internode (IN5) van Nanlin895
NGS-reeks:RNA van 15 individuen werd samengevoegd als één biologisch monster.Drie biologische replicaties van elk punt werden verwerkt voor de NGS-sequentie
TGS-sequentie:Stamregio's werden verdeeld in drie regio's, namelijk top, IN1-IN3 en IN4-IN5.Elke regio werd verwerkt voor PacBio-sequencing met vier typen bibliotheken: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb en 3-10 kb.

Belangrijkste resultaten

1. Er werden in totaal 87150 transcripten van volledige lengte geïdentificeerd, waarin 2081 nieuwe isovormen en 62058 nieuwe alternatief gesplitste isovormen werden geïdentificeerd.
Er werden 2.1187 lncRNA- en 356 fusiegenen geïdentificeerd.
3. Van primaire groei tot secundaire groei werden 15838 differentieel tot expressie gebrachte transcripten van 995 differentieel tot expressie gebrachte genen geïdentificeerd.In alle DEG's waren 1216 transcriptiefactoren, waarvan de meeste nog niet zijn gerapporteerd.
4.GO-verrijkingsanalyse onthulde het belang van celdeling en oxidatie-reductieproces in primaire en secundaire groei.

Alternatieve splitsingsgebeurtenissen en verschillende isovormen
WGCNA-analyse van transcriptiefactoren

Referentie

Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.De ontwikkelingsdynamiek van het Populus-stamtranscriptoom.Plantenbiotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958