मेटाजेनोमिक्स
नानोपोर सिक्वेन्सिङ प्रयोग गरेर माइक्रोबायोमबाट पूर्ण, बन्द ब्याक्टेरियल जीनोमहरू
नानोपोर सिक्वेन्सिङ |मेटाजेनोमिक्स |MAGs |ब्याक्टेरियल जीनोम सर्कुलराइजेशन |पेटको माइक्रोबायोटा
हाइलाइटहरू
1. यस अध्ययनमा DNA को लामो टुक्राहरू निकाल्ने एउटा नयाँ विधि प्रस्तुत गरिएको थियो, जसले 300 mg स्टूलबाट लामो-पढ्ने अनुक्रमका लागि उपयुक्त शुद्ध HMW DNA को माइक्रोग्राम निकासी प्राप्त गर्यो।
2. एक एसेम्बली वर्कफ्लो, लेथ, यस अध्ययनमा पेश गरिएको थियो, जहाँ MAGs लाई लामो पढाइहरूद्वारा भेला गरिएको थियो र छोटो-पढाइहरूद्वारा सुधार गरिएको थियो।
3. लेथलाई नकली मिश्रण द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो।12 मध्ये 7 ब्याक्टेरियाहरू सफलतापूर्वक एकल कन्टिग्समा जम्मा भएका थिए र 3 लाई चार वा कम कन्टिगहरूमा जम्मा गरिएको थियो।
4. लेथ थप स्टूल नमूनाहरूमा लागू गरियो, जसले 20 गोलाकार जीनोमहरू उत्पन्न गर्यो, जसमा प्रीभोटेला कोप्री र उम्मेदवार सिबियोब्याक्टर एसपी।, जुन मोबाइल आनुवंशिक तत्वहरूमा धनी हुनको लागि परिचित थियो।
मुख्य उपलब्धि
HWM DNA को लागि निष्कर्षण प्रोटोकल
लामो-पढिएको अनुक्रममा आधारित पेट मेटाजेनोमिक अध्ययनहरू लामो समयदेखि स्टूलबाट उच्च आणविक वजन (HMW) DNA निकाल्ने कठोरताबाट पीडित छन्।यस अध्ययनमा, परम्परागत विधिहरूमा मोती पिटेर व्यापक कतर्नबाट बच्नको लागि एक इन्जाइम-आधारित निकासी प्रोटोकल पेश गरिएको थियो।निम्न चित्रमा देखाइए अनुसार, नमूनाहरूलाई सबैभन्दा पहिले इन्जाइमहरूको ककटेलद्वारा उपचार गरिएको थियो, जसमा लाइटिक इन्जाइम, मेटापोलिजाइम, इत्यादि कोषको पर्खालहरू घटाउनका लागि।रिलिज गरिएको डीएनए फेनोल-क्लोरोफर्म प्रणालीद्वारा निकालिएको थियो, त्यसपछि प्रोटिनेज के र आरनेज ए पाचन, स्तम्भ-आधारित शुद्धीकरण र एसपीआरआई साइज चयन।यस विधिले 300 मिटर स्टूलबाट HMW DNA को माइक्रोग्रामहरू उत्पादन गर्न व्यवस्थित गर्यो, जसले गुणस्तर र मात्रा दुवैको सन्दर्भमा लामो-पढ्ने अनुक्रम आवश्यकताहरू पूरा गर्दछ।
चित्र 1. HWM DNA निकासी योजना
खराद को योजना प्रवाह
निम्न चित्रमा वर्णन गरिए अनुसार, लेथले गुप्पी प्रयोग गरेर कच्चा आधार कलिङ प्रक्रियाको अवस्थित प्रक्रिया समावेश गर्दछ।दुई लामो-पढिएको असेंबलीहरू त्यसपछि Flye र Canu द्वारा अलग-अलग उत्पादन गरिन्छ र त्यसपछि गलत-विधानसभा पत्ता लगाउने र हटाउने।दुई उप-सभाहरू द्रुत मर्जको साथ मर्ज गरिएका छन्।मर्ज गरेपछि, मेगाबेस स्तरमा ठूला एसेम्बलीहरूलाई सर्कुलराइजेसनको लागि जाँच गरिन्छ।पछि, यी सभाहरूमा सहमति परिष्करण छोटो पढाइको साथ प्रक्रिया गरिन्छ।अन्तिम भेला भएका ब्याक्टेरियल जीनोमहरू अन्तिम गलत-एसेम्बली पत्ता लगाउन र हटाउनका लागि प्रशोधन गरिन्छ।
चित्र २. लेथ असेंबलीको योजना प्रवाह
नक्कली ब्याक्टेरिया मिश्रणको साथ खरादको मूल्याङ्कन
ग्राम-सकारात्मक र ग्राम-नकारात्मक ब्याक्टेरिया दुवै समावेश भएको मानक ATCC 12-प्रजाति मिश्रणलाई MAG असेंबलीमा nanopore अनुक्रमण प्लेटफर्म र खरादको कार्यसम्पादन मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरिएको थियो।5.9 kb को N50 को साथ nanopore प्लेटफर्म द्वारा कुल 30.3 Gb डाटा उत्पन्न भएको थियो।खरादले अन्य लामो-पढिएको असेंबली उपकरणहरूको तुलनामा एसेम्बली N50 लाई 1.6 देखि 4-गुनासम्म र हाइब्रिड एसेम्बली उपकरणहरूको तुलनामा 2 देखि 9-गुनासम्म सुधार गर्यो।12 ब्याक्टेरियल जीनोमहरू मध्ये, सात एकल कन्टिगहरूमा भेला गरियो (चित्र 3. कालो थोप्ला भएको सर्कस)।थप तीनलाई चार वा कम कन्टिगहरूमा भेला गरियो, जसमा सबैभन्दा अपूर्ण असेम्बलीमा एकल कन्टिगमा 83% जीनोम समावेश थियो।
चित्र 3. परिभाषित 12-प्रजाति ब्याक्टेरिया मिश्रणमा जीनोम असेंबलीहरू
स्टूल नमूनाहरूमा खरादको प्रयोग
यो विधि मानव स्टूल नमूनाहरूमा जीव पहिचान र एसेम्बली कन्टिग्युटीलाई अवस्थित विधिहरू, पढ्ने-क्लाउड र छोटो-पढ्ने आधारित विश्लेषणसँग तुलना गर्नको लागि थप लागू गरिएको थियो।समावेश गरिएका तीनवटा नमूनाहरूबाट, नयाँ इन्जाइम-आधारित निकासीले कम्तिमा 1 μg प्रति 300 mg इनपुट मास उत्पादन गर्यो।यी HMW DNA को नानोपोर सिक्वेन्सिङले क्रमशः 4.7 kb, 3.0kb र 3.0kb को N50 सँग लामो-रीडहरू उत्पन्न गर्यो।उल्लेखनीय रूपमा, वर्तमान विधिले अवस्थित विधिहरूको तुलनामा माइक्रोबियल पत्ता लगाउन ठूलो सम्भावना देखाएको छ।छोटो-पढ्ने र पढ्ने-क्लाउडको तुलनामा तुलनात्मक रूपमा उच्च प्रजाति-स्तर अल्फा विविधता यहाँ देखाइएको थियो।यसबाहेक, छोटो-पढ्ने विश्लेषणबाट सबै जेनेराहरू, सामान्यतया lysis-प्रतिरोधी ग्राम-सकारात्मक जीवहरू पनि, यस विधिद्वारा पुनःप्राप्त गरियो।
चित्र 4. नानोपोर, छोटो-पढ्ने र पढ्ने-क्लाउड विधिहरू द्वारा निर्धारित अल्फा विविधता र ट्याक्सनोमिक कम्पोनेन्टहरू
कच्चा डाटाको तीन देखि छ गुणा कम इनपुटको बावजुद, छोटो-पढ्ने र पढ्ने-क्लाउड एसेम्बली भन्दा खरादले धेरै लामो पूर्ण-विधानसभा N50 उत्पादन गर्यो।मस्यौदा जीनोमहरू कन्टिग बिनिङद्वारा उत्पादन गरिएको थियो, जसमा मस्यौदाहरूलाई पूर्णता, प्रदूषण, एकल-प्रतिलिपि कोर जीनहरू, इत्यादिको आधारमा "उच्च-गुणस्तर" वा "आंशिक" मा वर्गीकृत गरिएको थियो। लामो-पढिएको एसेम्बलीले तुलनात्मक रूपमा कम लागतमा धेरै उच्च समुचितता देखाएको छ। छोटो पढ्न र पढ्ने क्लाउडमा।
चित्र 5. प्रत्येक विधिको प्रति-जीव असेंबली कन्टिग्युटी
यसबाहेक, वर्तमान असेंबली दृष्टिकोण बन्द, गोलाकार जीनोमहरू उत्पादन गर्न सक्षम छ।स्टूल नमूनाहरूमा, आठ उच्च-गुणवत्ता, एकल-कन्टिग जीनोमहरू भेला भएका थिए र तीमध्ये पाँचले सटीक सर्कुलराइजेसन हासिल गरे।लामो-पढ्ने दृष्टिकोणले जीनोमहरूमा दोहोरिने तत्वहरू समाधान गर्न प्रभावशाली क्षमता देखाउँदछ।सर्कुलर गरिएकोP. copriजीनोम यस दृष्टिकोणबाट उत्पन्न भएको थियो, जुन उच्च-डिग्रीको अनुक्रम पुनरावृत्ति समावेश गर्न चिनिन्छ।छोटो-पढ्ने र पढ्ने-क्लाउड द्वारा यो जीनोमको उत्कृष्ट एसेम्बली 4800X को कभरेज गहिराइको साथमा पनि, 130 kb को N50 भन्दा बढी छैन।यी उच्च प्रतिलिपि संख्या तत्वहरू लामो-पढ्ने दृष्टिकोण द्वारा पूर्ण रूपमा समाधान गरिएको थियो, जुन प्रायः छोटो-पढ्ने वा पढ्ने-क्लाउड सम्मेलनहरूको ब्रेकिङ बिन्दुहरूमा पाइन्छ।यस अध्ययनमा अर्को बन्द जीनोम रिपोर्ट गरिएको थियो, जसलाई हालै वर्णन गरिएको सदस्य मानिएको थियोसिबायोब्याक्टरक्लेड।8.5 देखि 65.9 kb सम्मको यस बन्द सभामा पाँच पुटेटिभ फेजहरू पहिचान गरिएको थियो।
चित्र 6. P.copri र Cibiobacter sp को बन्द जीनोमहरूको सर्कोस रेखाचित्र।
सन्दर्भ
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020)।नानोपोर सिक्वेन्सिङ प्रयोग गरेर माइक्रोबायोमबाट पूर्ण, बन्द ब्याक्टेरियल जीनोमहरू।प्रकृति जैव प्रौद्योगिकी,38(६), ७०१-७०७।
प्राविधिक र हाइलाइटहरू विभिन्न रिसर्च एरेनामा विभिन्न उच्च-थ्रुपुट सिक्वेन्सिङ टेक्नोलोजीहरूको सबैभन्दा भर्खरको सफल अनुप्रयोगको साथसाथै प्रयोगात्मक डिजाइन र डाटा माइनिङमा शानदार विचारहरू साझेदारी गर्ने उद्देश्य छ।
पोस्ट समय: जनवरी-07-2022