METAGENOMIKA
Ġenomi batteriċi kompluti u magħluqin minn mikrobijomi bl-użu tas-sekwenzjar tan-nanopori
Sekwenzar tan-Nanopori |Metaġenomika |MAGs |Ċirkolarizzazzjoni tal-ġenoma batterjali |Mikrobijota tal-musrana
Il-punti ewlenin
1.Metodu ġdid biex jiġu estratti frammenti twal ta 'DNA ġie ppreżentat f'dan l-istudju, li kiseb estrazzjoni ta' mikrogramma ta 'DNA HMW pur, adattat għal sekwenzar ta' qari fit-tul minn 300 mg ta 'ippurgar
2.Fluss tax-xogħol ta 'assemblaġġ, Torn, ġie introdott f'dan l-istudju, fejn MAGs ġew assemblati b'qari twal u kkoreġuti b'qari qosra.
3.Lathe ġie evalwat b'taħlita finta.7 minn 12-il batterja ġew immuntati b'suċċess f'kontigs singoli u 3 ġew immuntati f'erba 'kontigs jew inqas.
4.Lathe ġie applikat aktar għal kampjuni tal-ippurgar, li ġġeneraw 20 ġenomi ċirkolarizzati, inklużi Prevotella copri u l-kandidat Cibiobacter sp., li kienu magħrufa li huma sinjuri f'elementi ġenetiċi mobbli.
Kisba Prinċipali
Protokoll ta' estrazzjoni għad-DNA HWM
Studji metagenomic tal-imsaren ibbażati fuq is-sekwenzjar li jaqraw fit-tul ilu jsofru minn ebusija fl-estrazzjoni tad-DNA ta 'piż molekulari għoli (HMW) mill-ippurgar.F'dan l-istudju, ġie introdott protokoll ta 'estrazzjoni bbażat fuq l-enżimi biex jiġi evitat shearing estensiv bit-taħbit taż-żibeġ f'metodi tradizzjonali.Kif muri fil-figura li ġejja, il-kampjuni l-ewwel ġew ittrattati b'cocktail ta 'enzimi, inkluż enzima litika, MetaPolyzyme, eċċ biex jiddegradaw il-ħitan taċ-ċelluli.Id-DNA rilaxxat ġie estratt b'sistema Phenol-chloroform, segwita minn diġestjoni Proteinase K u RNase A, purifikazzjoni bbażata fuq kolonna u għażla tad-daqs SPRI.Dan il-metodu rnexxielu jagħti mikrogrammi ta 'HMW DNA minn 300 m ta' ippurgar, li jissodisfa r-rekwiżiti tas-sekwenzjar li jinqraw fit-tul f'termini kemm ta 'kwalità kif ukoll ta' kwantità.
Figura 1. Skema ta 'estrazzjoni tad-DNA HWM
Skema tal-fluss tat-torn
Kif deskritt fil-figura li ġejja, Torn fih proċess eżistenti ta 'proċess ta' bażi mhux maħdum bl-użu ta 'Guppy.Żewġ assemblaġġi li jinqraw fit-tul huma mbagħad prodotti minn Flye u Canu separatament segwiti minn skoperta u tneħħija ta 'assemblaġġ ħażin.Iż-żewġ sub-assemblaġġi huma magħquda ma 'quickmerge.Malli jingħaqdu, assemblaġġi kbar fil-livell tal-megabase mbagħad jiġu ċċekkjati għaċ-ċirkolarizzazzjoni.Sussegwentement, ir-raffinament tal-kunsens dwar dawn l-assemblaġġi jiġi pproċessat b'qari qosra.Il-ġenomi batteriċi finali immuntati jiġu pproċessati għall-iskoperta u t-tneħħija finali ta 'assemblaġġ ħażin.
Figura 2. Skema tal-fluss tal-assemblaġġ tat-torn
Evalwazzjoni ta 'torn b'taħlita ta' batterji finta
Taħlita standard ta '12-il speċi ATCC li tinkludi kemm batterji Gram-pożittivi kif ukoll Gram-negattivi ġiet impjegata biex tevalwa l-prestazzjoni tal-pjattaforma tas-sekwenzjar tan-nanopori u Torn fl-assemblaġġ MAG.Total ta 'dejta ta' 30.3 Gb ġie ġġenerat minn pjattaforma nanopore b'N50 ta '5.9 kb.It-torn tejjeb ħafna l-assemblaġġ N50 għal 1.6 sa 4 darbiet meta mqabbel ma 'għodod oħra ta' assemblaġġ li jinqraw fit-tul u 2 sa 9 darbiet meta mqabbla ma 'għodod ta' assemblaġġ ibridi.Minn 12-il ġenoma batterjali, sebgħa ġew assemblati f'kontigs singoli (Figura 3. Circos b'tikka sewda).Tlieta oħra ġew assemblati f'erba 'kontigs jew inqas, li fihom l-assemblaġġ l-aktar mhux komplut kien fih 83% tal-ġenoma f'kontig wieħed.
Figura 3. Assemblaġġi tal-ġenoma f'taħlita definita ta' 12-il speċi batterjali
Applikazzjoni tat-torn fil-kampjuni tal-ippurgar
Dan il-metodu ġie applikat aktar għal kampjuni tal-ippurgar tal-bniedem sabiex titqabbel l-identifikazzjoni tal-organiżmu u l-kontigwità tal-assemblaġġ ma 'metodi eżistenti, analiżi bbażata fuq read-cloud u qari qasir.Mit-tliet kampjuni involuti, l-estrazzjoni l-ġdida bbażata fuq l-enżimi tat mill-inqas 1 μg għal kull 300 mg tal-massa tal-input.Is-sekwenzjar tan-nanopori ta 'dawn id-DNA HMW ġġenera qari fit-tul b'N50 ta' 4.7 kb, 3.0kb u 3.0kb rispettivament.Notevolment, il-metodu preżenti wera potenzjal kbir fl-iskoperta tal-mikrobi meta mqabbel mal-metodi eżistenti.Hawnhekk intweriet diversità alfa fil-livell tal-ispeċi relattivament ogħla meta mqabbla ma' qari qasir u sħaba qari.Barra minn hekk, il-ġeneri kollha minn analiżi qasira, anke organiżmi Gram-pożittivi tipikament reżistenti għall-liżi, ġew irkuprati b'dan il-metodu.
Figura 4. Id-diversità alfa u l-komponenti tassonomiċi ddeterminati minn Nanopore, metodi ta’ qari qasir u sħaba ta’ qari
It-torn wassal ħafna itwal ta 'assemblaġġ sħiħ N50 minn assemblaġġ ta' qari qasir u sħaba ta 'qari, minkejja input ta' dejta mhux maħduma minn tlieta sa sitt darbiet aktar baxxa.L-abbozzi tal-ġenomi ġew prodotti minn contig binning, li fih l-abbozzi ġew ikklassifikati fi "kwalità għolja" jew "parzjali" ibbażati fuq kompletezza, kontaminazzjoni, ġeni tal-qalba b'kopja waħda, eċċ. Assemblaġġ li jaqra fit-tul wera kontigwità ħafna ogħla bi prezz aktar baxx meta mqabbel to short-read u read-cloud.
Figura 5. Kontigwità ta 'assemblaġġ għal kull organiżmu ta' kull metodu
Barra minn hekk, l-approċċ tal-assemblaġġ preżenti huwa kapaċi jagħti ġenomi magħluqa u ċirkolari.Fil-kampjuni tal-ippurgar, ġew assemblati tmien ġenomi ta 'kwalità għolja, single-contig u ħamsa minn dawn kisbu ċirkolarizzazzjoni perċiża.Approċċ fit-tul wera wkoll kapaċità impressjonanti biex isolvi elementi ripetittivi fil-ġenomi.ĊirkularizzatP. copriil-ġenoma ġie ġġenerat minn dan l-approċċ, li kien magħruf li fih grad għoli ta 'repetizzjoni ta' sekwenza.L-aħjar assemblaġġ ta 'dan il-ġenoma permezz ta' qari qasir u sħaba ta 'qari qatt ma qabeż N50 ta' 130 kb, anke b'fond ta 'kopertura ta' 4800X.Dawn l-elementi ta 'numru għoli ta' kopji ġew solvuti bis-sħiħ permezz ta 'approċċ ta' qari fit-tul, li ħafna drabi jinstab fil-punti ta 'ksur ta' assemblaġġi ta 'qari qasir jew sħaba ta' qari.Ġenoma magħluq ieħor ġie rrappurtat f'dan l-istudju, li kien maħsub li jkun membru ta 'deskritt reċentementCibiobacterclade.Ħames phage putattiv ġew identifikati f'din l-assemblaġġ magħluq, li jvarjaw minn 8.5 sa 65.9 kb.
Figura 6. Dijagramma Circos ta 'ġenomi magħluqa ta' P.copri u Cibiobacter sp.
Referenza
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Ġenomi batteriċi kompluti u magħluqin minn mikrobijomi bl-użu tas-sekwenzjar tan-nanopori.Bijoteknoloġija tan-natura,38(6), 701-707.
It-teknoloġija u l-punti ewlenin timmira li taqsam l-aktar applikazzjoni reċenti b'suċċess ta 'teknoloġiji differenti ta' sekwenzar b'rendiment għoli f'diversi arena ta 'riċerka kif ukoll ideat brillanti fid-disinn sperimentali u t-tħaffir tad-dejta.
Ħin tal-post: Jan-07-2022