TRASKRIPTOMIKA
natura
KOMUNIKAZZJONIJIET
Karatterizzazzjoni tat-traskrizzjoni fit-tul sħiħ tal-mutazzjoni SF3B1 fil-lewkimja limfoċitika kronika tiżvela r-regolazzjoni 'l isfel ta' introni miżmuma
Traskrizzjonijiet full-length|Sekwenzar tan-nanopori|Analiżi tal-isoforma alternattiva
Sfond
SMutazzjonijiet omatiċi fil-fattur ta 'splicing SF3B1 ġie rrappurtat b'mod wiesa' li jassoċja ma 'diversi kanċers, inkluż lewkimja limfoċitika kronika (CLL), melanoma uveali, kanċer tas-sider, eċċ. Barra minn hekk, studji transcriptomic ta' qari qasir urew mudelli ta 'splicing aberranti indotti minn mutazzjonijiet SF3B1.Madankollu, studji dwar dawn ix-xejriet ta 'splicing alternattivi ilhom limitati għal-livell ta' avveniment u nuqqas ta 'għarfien fuq livell ta' isoform minħabba l-limitazzjoni ta 'traskrizzjonijiet immuntati qosra qosra.Hawnhekk, il-pjattaforma tas-sekwenzjar tan-nanopori ġiet introdotta biex tiġġenera traskrizzjonijiet ta 'tul sħiħ, li taw is-setgħa l-invertigazzjoni fuq iżoformi AS.
Disinn Sperimentali
Esperimenti
Raggruppament:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E mutazzjoni);3. Ċelloli B normali
Strateġija ta' sekwenzar:Is-sekwenzjar tal-librerija MinION 2D, is-sekwenzjar tal-librerija PromethION 1D;dejta qosra mill-istess kampjuni
Pjattaforma tas-sekwenzjar:ONT MinION;ONT PromethION;
Analiżi Bijoinformatika
Riżultati
Atotal ta' 257 miljun qari ġew iġġenerati minn 6 kampjuni CLL u 3 ċelluli B.Bħala medja ta’ 30.5% ta’ dawn il-qari ġew identifikati bħala traskrizzjonijiet full-length.
FAnaliżi ta 'isoform alternattiva ta' ull-length ta 'RNA(FLAIR) ġiet żviluppata biex tiġġenera sett ta' isoforms ta 'kunfidenza għolja.FLAIR jista' jinġabar fil-qosor bħala:
Nanopore jaqra l-allinjament: identifika l-istruttura ġenerali tat-traskrizzjoni bbażata fuq il-ġenoma ta 'referenza;
Skorrezzjoni tal-junction plice: korretta sekwenza żbalji (aħmar) ma splice sit minn jew introns annotati, introns minn dejta qari qasir jew it-tnejn;
Collapse: sommarju isoforms rappreżentattivi bbażati fuq splice junction ktajjen (first-pass sett).Agħżel isofrom ta 'kunfidenza għolja bbażata fuq in-numru ta' qari ta 'appoġġ (Limita: 3).
Figura 1. Analiżi FLAIR biex tidentifika iżoformi full-leth assoċjati ma' mutazzjoni SF3B1 f'CLL
FLAIR Identifika 326,699 iżoformi spliced ta' kunfidenza għolja, li 90% minnhom huma iżoformi ġodda.Ħafna minn dawn l-iżoformi mhux annotati nstabu li huma kombinazzjonijiet ġodda ta 'juntions splice magħrufa (142,971), filwaqt li l-bqija iżoformi ġodda kien fihom jew miżmuma intron (21,700) jew exon ġdid (3594).
Lsekwenzi ong-qari jagħtu s-setgħa lill-identifikazzjoni ta 'siti ta' splice mibdula SF3B1-K700E mutant fil-livell ta 'isoforma.35 alternattiva 3'SSs u 10 alternattiva 5'SSs instabu li huma mqabbda b'mod differenzjali sinifikanti bejn SF3B1-K700E u SF3B1-WT.33 mill-35 alterazzjoni ġew skoperti ġodda minn sekwenzi li jinqraw fit-tul.Fid-dejta Nanopore, id-distribuzzjoni tad-distanza bejn 3'SSs mibdula SF3B1-K700E għal qċaċet siti kanoniċi hija ta 'madwar -20 bp, li hija differenti b'mod sinifikanti minn distribuzzjoni ta' kontroll, simili għal dak li ġie rrappurtat fis-sekwenzi ta 'qari qasir CLL.Ġew analizzati iżoformi tal-ġene ERGIC3, fejn iżoforma ġdida li fiha s-sit ta 'splice prossimali nstabet aktar abbundanti f'SF3B1-K700E.Kemm 3'SS prossimali kif ukoll distali kienu assoċjati ma 'mudelli AS distinti li jiġġeneraw iżoformi multipli.
Figura 2. Mudelli alternattivi ta 'splicing 3′ identifikati b'dejta tas-sekwenzjar tan-nanopori
L-analiżi tal-użu tal-avvenimenti tal-IR ilha limitata għal żmien twil f'analiżi bbażata fuq qari qasir minħabba l-fiduċja fl-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-IR.L-espressjoni ta 'isoformi IR f'SF3B1-K700E u SF3B1-WT ġew ikkwantifikati abbażi ta' sekwenzi nanopori, u żvelaw regolamentazzjoni 'l isfel globali ta' iżoformi IR f'SF3B1-K700E.
Figura 4. Intensità tal-agrikoltura u konnettività tan-netwerk fi tliet sistemi tal-biedja (A u B);Analiżi każwali tal-foresti(C) u Relazzjoni bejn l-intensità agrikola u l-kolonizzazzjoni tal-AMF (D)
Figura 3. L-avvenimenti ta' rentenzjoni tal-intron huma rregolati b'mod aktar qawwi f'CLL SF3B1-K700E
Teknoloġija
Nanopore Sekwenzar ta' qari fit-tul
Nis-sekwenzjar tal-anopore huwa teknoloġija tas-sekwenzjar tas-sinjali elettriċi f'ħin reali ta 'molekula waħda.
DId-DNA jew l-RNA b'żewġ strandeds se jingħaqdu ma' proteina nanoporuża inkorporata fil-bijofilm u tinżel taħt it-tmexxija tal-proteina tal-mutur.
DIl-fergħat NA/RNA jgħaddu minn proteina tal-kanal nanopori b'ċerta rata taħt l-azzjoni tad-differenza tal-vultaġġ.
Molekoli jiġġeneraw sinjali elettriċi differenti skond l-istruttura kimika.
Rl-iskoperta ta' sekwenzi f'eal-time tinkiseb permezz ta' sejħa bażi.
Prestazzjoni ta 'sekwenzjar tat-traskriptome full-length
√ Saturazzjoni tad-Data
7 darbiet inqas qari meħtieġa biex tintlaħaq saturazzjoni tad-dejta komparabbli.
√ Identifikazzjoni tal-Istruttura tat-Traskrizzjoni
Identifikazzjoni ta 'varjanti strutturali diversi b'qari kunsenswali fit-tul sħiħ ta' kull traskrizzjoni....
√ Analiżi differenzjali fil-livell tat-traskrizzjoni -Ikxef bidliet moħbija minn qari qosra
Referenza
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Il-karatterizzazzjoni tat-traskrizzjoni fit-tul sħiħ tal-mutazzjoni SF3B1 fil-lewkimja limfoċitika kronika tiżvela downregulation ta 'introni miżmuma [J].Komunikazzjonijiet tan-Natura.
It-teknoloġija u l-punti ewlenin timmira li taqsam l-aktar applikazzjoni reċenti b'suċċess ta 'teknoloġiji differenti ta' sekwenzar b'rendiment għoli f'diversi arena ta 'riċerka kif ukoll ideat brillanti fid-disinn sperimentali u t-tħaffir tad-dejta.
Ħin tal-post: Jan-08-2022