Sekwenzar ta 'mRNA ta' tul sħiħ -PacBio
Vantaġġi tas-Servizz
● Qari dirett ta' molekula ta' cDNA ta' tul sħiħ mit-tarf 3' sa tarf 5'
● Riżoluzzjoni tal-livell tal-forma iso fl-istruttura tas-sekwenza
● Traskrizzjonijiet bi preċiżjoni u integrità għolja
● Kompatibbli ħafna mal-ispeċi vaiours
● Kapaċità kbira ta 'sekwenzjar b'4 pjattaformi ta' sekwenzar PacBio Sequel II mgħammra
● Esperjenza kbira b'aktar minn 700 proġett ta' sekwenzar tal-RNA bbażati fuq Pacbio
● Twassil tar-riżultat ibbażat fuq BMKCloud: It-tħaffir tad-dejta personalizzat disponibbli fuq il-pjattaforma.
● Servizzi ta 'wara l-bejgħ validi għal 3 xhur mat-tlestija tal-proġett
Speċifikazzjonijiet tas-Servizz
Pjattaforma: PacBio Sequel II
Librerija tas-sekwenzjar: Librerija mRNA arrikkita Poly A
Rendiment ta' data rakkomandat: 20 Gb/kampjun (Skond l-ispeċi)
FLNC（%）: ≥75%
*FLNC: Trażċipti mhux kimeriċi ta' tul sħiħ
Analiżi tal-bijoinformatika
● Ipproċessar tad-dejta mhux ipproċessata
● Identifikazzjoni tat-traskrizzjoni
● Struttura tas-sekwenza
● Kwantifikazzjoni tal-Espressjoni
● Annotazzjoni tal-Funzjoni
Rekwiżiti tal-Kampjun u Kunsinna
Rekwiżiti tal-Kampjun:
Nukleotidi:
| Konċ.(ng/μl) | Ammont (μg) | Purità | Integrità |
| ≥ 120 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Kontaminazzjoni limitata jew l-ebda proteina jew DNA murija fuq il-ġel. | Għall-pjanti: RIN≥7.5; Għall-annimali: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; elevazzjoni tal-linja bażi limitata jew l-ebda |
Tessut: Piż (niexef):≥1 g
* Għal tessut iżgħar minn 5 mg, nirrakkomandaw li tibgħat kampjun tat-tessut iffriżat flash (f'nitroġenu likwidu).
Sospensjoni taċ-ċelluli:Għadd taċ-ċelluli = 3 × 106- 1×107
*Nirrakkomandaw li nibgħatu lisat taċ-ċelluli ffriżati.F'każ li dik iċ-ċellula tgħodd iżgħar minn 5 × 105, flash iffriżat fin-nitroġenu likwidu huwa rakkomandat, li huwa preferibbli għall-estrazzjoni mikro.
Kampjuni tad-demm:Volum≥1 mL
Mikroorganiżmu:Massa ≥ 1 g
Kunsinna tal-Kampjun Rakkomandata
Kontenitur:
Tubu taċ-ċentrifuga ta' 2 ml (Fojl tal-landa mhux rakkomandat)
Tikkettjar tal-kampjun: Grupp+replika eż. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Konsenja:
1. Is-silġ niexef: Il-kampjuni jeħtieġ li jiġu ppakkjati f'boroż u midfuna fis-silġ niexef.
2. Tubi RNAstable: kampjuni RNA jistgħu jitnixxfu f'tubu ta 'stabbilizzazzjoni RNA (eż. RNAstable®) u jintbagħtu f'temperatura tal-kamra.
Fluss tax-Xogħol tas-Servizz
Disinn tal-esperimenti
Kunsinna tal-kampjun
Estrazzjoni tal-RNA
Kostruzzjoni ta' librerija
Sekwenzar
Analiżi tad-dejta
Servizzi ta' wara l-bejgħ
1.Distribuzzjoni tat-tul FLNC
It-tul tal-qari full-length mhux kimeriku (FLNC) jindika t-tul ta 'cDNA fil-kostruzzjoni tal-librerija.Id-distribuzzjoni tat-tul FLNC hija indikatur kruċjali fl-evalwazzjoni tal-kwalità tal-kostruzzjoni tal-librerija.
FLNC aqra distribuzzjoni tat-tul
2.Distribuzzjoni kompluta tat-tul tar-reġjun ORF
Aħna nużaw TransDecoder biex inbassru r-reġjuni li jikkodifikaw il-proteini u s-sekwenzi ta 'aċidi amminiċi korrispondenti biex niġġeneraw settijiet unigene, li fihom informazzjoni kompleta ta' traskrizzjoni mhux żejda fil-kampjuni kollha.
Tlesti distribuzzjoni tat-tul tar-reġjun ORF
3.KEGG analiżi ta 'arrikkiment mogħdija
Traskrizzjonijiet espressi b'mod differenzjali (DETs) jistgħu jiġu identifikati billi tiġi allinjata d-dejta tas-sekwenzjar tal-RNA bbażata fuq NGS fuq settijiet ta 'traskrizzjonijiet ta' tul sħiħ ġġenerati mid-dejta tas-sekwenzjar tal-PacBio.Dawn id-DETs jistgħu jiġu pproċessati aktar għal analiżi funzjonali varji, eż. analiżi ta' arrikkiment tal-mogħdija KEGG.
DET KEGG mogħdija arrikkiment -Dot plot
Kawża BMK
Id-dinamika ta 'żvilupp tat-traskriptoma ta' zokk Populus....
Ippubblikat: Ġurnal tal-Bijoteknoloġija tal-Pjanti, 2019
Strateġija ta' sekwenzar:
Ġbir tal-kampjuni:reġjuni taz-zokk: apex, l-ewwel internode(IN1), it-tieni internode(IN2), it-tielet internode(IN3), internode(IN4) u internode(IN5) minn Nanlin895
Sekwenza NGS:RNA ta' 15-il individwu ġew miġbura bħala kampjun bijoloġiku wieħed.Tliet repliki bijoloġiċi ta 'kull punt ġew ipproċessati għas-sekwenza NGS
Sekwenza TGS:Ir-reġjuni taz-zokk kienu maqsuma fi tliet reġjuni, jiġifieri l-apex, IN1-IN3 u IN4-IN5.Kull reġjun ġie pproċessat għal sekwenzar PacBio b'erba 'tipi ta' libreriji: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb u 3-10 kb.
Riżultati ewlenin
1.Ġew identifikati total ta '87150 traskrizzjonijiet ta' tul sħiħ, li fihom, ġew identifikati 2081 iżoformi ġodda u 62058 iżoformi spliced alternattivi ġodda.
Ġew identifikati 2.1187 lncRNA u 356 ġeni tal-fużjoni.
3.Mit-tkabbir primarju għal tkabbir sekondarju, ġew identifikati 15838 traskrizzjonijiet espressi b'mod differenzjali minn 995 ġeni espressi b'mod differenzjali.Fid-DEGs kollha, 1216 kienu fatturi ta 'traskrizzjoni, li l-biċċa l-kbira tagħhom għadhom ma ġewx irrappurtati.
L-analiżi ta 'arrikkiment 4.GO żvelat l-importanza tad-diviżjoni taċ-ċelluli u l-proċess ta' ossidazzjoni-tnaqqis fit-tkabbir primarju u sekondarju.
Avvenimenti ta 'splicing alternattivi u isoforms differenti
Analiżi WGCNA fuq fatturi ta 'traskrizzjoni....
Referenza
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.Id-dinamika ta 'żvilupp tat-traskriptoma ta' zokk Populus....Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
