ТРАНСКРИПТОМИК
байгаль
ХАРИЛЦАА
Архаг лимфоцитын лейкемийн SF3B1 мутацийн бүрэн хэмжээний транскриптийн шинж чанар нь хадгалагдсан интроны зохицуулалтыг бууруулдаг.
Бүрэн хэмжээний хуулбарууд|Нано нүх сүвний дараалал|Альтернатив изоформ шинжилгээ
Суурь
SSF3B1 залгах хүчин зүйл дэх омматик мутаци нь архаг лимфоцитын лейкеми (CLL), хөхний булчирхайн меланома, хөхний хорт хавдар гэх мэт янз бүрийн хорт хавдартай холбоотой болох нь өргөн тархсан байдаг. Үүнээс гадна богино уншсан транскриптомийн судалгаагаар SF3B1 мутациас үүдэлтэй гажиг залгах хэв маягийг илрүүлсэн.Гэсэн хэдий ч эдгээр өөр залгах хэв маягийн талаархи судалгаанууд нь үйл явдлын түвшинд хязгаарлагдаж, богино хугацаанд уншсан угсарсан транскриптийн хязгаарлалтын улмаас изоформын түвшний мэдлэг дутмаг байсаар ирсэн.Энд бүрэн хэмжээний транскрипт үүсгэхийн тулд нанопорын дарааллын платформыг нэвтрүүлсэн бөгөөд энэ нь AS изоформ дээр судалгаа хийх боломжийг олгосон.
Туршилтын дизайн
Туршилтууд
Бүлэглэх:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E мутаци);3. Хэвийн В эсүүд
Дараалсан стратеги:MinION 2D номын сангийн дараалал, PromethION 1D номын сангийн дараалал;ижил дээжээс авсан богино хугацааны өгөгдлийг унших
Дараалсан платформ:ONT MinION;ONT PromethION;
Био-информатик шинжилгээ
Үр дүн
АCLL-ийн 6 дээж, 3 В эсээс нийт 257 сая уншилт хийсэн.Дунджаар эдгээр уншлагын 30.5% нь бүрэн хэмжээний хуулбар гэж тодорхойлсон байна.
FRNA-ийн альтернатив изоформ шинжилгээг (FLAIR) өндөр итгэлтэй изоформ үүсгэх зорилгоор боловсруулсан.FLAIR-ийг дараах байдлаар дүгнэж болно.
Nanopore уншдаг тэгшитгэх: лавлагаа геном дээр үндэслэн ерөнхий транскрипт бүтцийг тодорхойлох;
Splice уулзвар залруулга: тайлбартай интрон, богино уншсан өгөгдлийн интрон эсвэл хоёулангийнх нь холболтын талбай бүхий дарааллын алдааг (улаан) засах;
COllapse: холболтын гинжин хэлхээнд тулгуурлан төлөөлөх изоформуудыг нэгтгэн бичнэ үү (эхний дамжуулалтын багц).Дэмжих уншлагын тоонд тулгуурлан өндөр итгэлтэй изофинг сонгоно уу(Босго: 3).
Зураг 1. CLL-ийн SF3B1 мутацитай холбоотой бүрэн хэмжээний изоформыг тодорхойлох FLAIR шинжилгээ
FLAIR 326,699 өндөр итгэлтэй холбосон изоформыг тодорхойлсон бөгөөд тэдгээрийн 90% нь шинэ изоформ юм.Эдгээр тэмдэглэгээгүй изоформуудын ихэнх нь мэдэгдэж буй холболтын шинэ хослолууд (142,971) байсан бол бусад шинэ изоформууд нь хадгалагдсан интрон (21,700) эсвэл шинэ экзон (3594) агуулсан байдаг.
LУншсан дараалал нь изоформын түвшний мутант SF3B1-K700E-өөрчлөгдсөн холболтын цэгүүдийг тодорхойлох боломжийг олгодог.35 өөр 3'SS ба 10 өөр 5'SS нь SF3B1-K700E болон SF3B1-WT хооронд мэдэгдэхүйц ялгаатай байгаа нь тогтоогдсон.35 өөрчлөлтийн 33-ыг нь удаан уншсан дарааллаар шинээр илрүүлсэн.Nanopore өгөгдөлд SF3B1-K700E-өөр өөрчилсөн 3'SS-ийн каноник цэгүүдийн оргил хүртэлх зайны хуваарилалт -20 bp орчим байгаа нь CLL-ийн богино унших дараалалд мэдээлэгдсэнтэй адил хяналтын тархалтаас эрс ялгаатай байна.ERGIC3 генийн изоформд дүн шинжилгээ хийсэн бөгөөд SF3B1-K700E-д ойрын залгаас агуулсан шинэ изоформ илүү олдсон байна.Проксимал ба дистал 3'SS хоёулаа олон изоформ үүсгэдэг AS-ийн ялгаатай загвартай холбоотой байв.
Зураг 2. Нанопорын дарааллын өгөгдлөөр тодорхойлсон өөр 3′ залгах загвар
IR үйл явдлын ашиглалтын шинжилгээ нь IR таних болон тоон үзүүлэлтэд итгэлтэй байдгаас шалтгаалан богино уншихад суурилсан шинжилгээнд удаан хугацаагаар хязгаарлагдаж ирсэн.SF3B1-K700E болон SF3B1-WT дахь IR изоформуудын илэрхийлэлийг нанопорын дараалалд үндэслэн хэмжсэн нь SF3B1-K700E дахь IR изоформын дэлхийн хэмжээнд буурах зохицуулалтыг илрүүлсэн.
Зураг 4. Газар тариалангийн эрч хүч ба гурван газар тариалангийн систем (А ба В) дахь сүлжээний холболт;Ойн санамсаргүй шинжилгээ(C) ба хөдөө аж ахуйн эрчимжилт ба AMF-ийн колоничлолын хоорондын хамаарал (D)
Зураг 3. CLL SF3B1-K700E-д интроны түрээсийн үйл явдлууд илүү хүчтэй буурдаг.
Технологи
Nanopore Long-Read Sequencing
Nанопорын дараалал нь нэг молекулын бодит цагийн цахилгаан дохионы дараалал тогтоох технологи юм.
DДавхар судалтай ДНХ эсвэл РНХ нь био хальсанд шингэсэн нано сүвэрхэг уурагтай холбогдож моторт уургийн нөлөөгөөр тайлагдана.
DНА/РНХ-ийн хэлхээ нь хүчдэлийн зөрүүний нөлөөн дор тодорхой хурдтайгаар нано нүхний сувгийн уургаар дамждаг.
MОлекулууд нь химийн бүтцийн дагуу өөр өөр цахилгаан дохио үүсгэдэг.
Rдарааллыг цаг тухайд нь илрүүлэх нь үндсэн дуудлагын тусламжтайгаар хийгддэг.
Бүрэн хэмжээний транскриптомын дарааллын гүйцэтгэл
√ Өгөгдлийн ханалт
Харьцуулж болохуйц өгөгдлийн ханалтад хүрэхийн тулд 7 дахин бага унших шаардлагатай.
√ Транскриптийн бүтцийг тодорхойлох
Транскрипт бүрийг бүрэн хэмжээгээр уншиж, зөвшилцөл бүхий олон төрлийн бүтцийн хувилбаруудыг тодорхойлох
√ Транскриптийн түвшний дифференциал шинжилгээ -Богино уншилтаар нуугдаж буй өөрчлөлтүүдийг илрүүлэх
Лавлагаа
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Архаг лимфоцитын лейкемийн SF3B1 мутацийн бүрэн хэмжээний транскриптийн шинж чанар нь хадгалагдсан интрон [J]-ийн бууралтыг илрүүлдэг.Байгалийн харилцаа холбоо.
Техник ба онцлох үйл явдал Судалгааны янз бүрийн талбарт өндөр бүтээмжтэй дэс дарааллын технологийн хамгийн сүүлийн үеийн амжилттай хэрэглэгдэхүүн, туршилтын дизайн, өгөгдөл олборлох гайхалтай санаануудыг хуваалцах зорилготой.
Шуудангийн цаг: 2022-01-08