Бүрэн урттай мРНХ-ийн дараалал-нанопор
Үйлчилгээний давуу тал
● Бага дарааллын хазайлт
● Бүрэн хэмжээний cDNA молекулуудыг илрүүлэх
● Ижил тооны хуулбарыг хамрахын тулд бага өгөгдөл шаардагдана
● Нэг генийн олон изоформыг тодорхойлох
● Изоформын түвшинд илэрхийллийн хэмжигдэхүүн
Үйлчилгээний үзүүлэлтүүд
| Номын сан | Платформ | Санал болгож буй өгөгдлийн гарц (Гб) | Чанарын шалгалт |
| cDNA-PCR(Poly-A баяжуулсан) | Nanopore PromethION P48 | 6 Гб/дээж (Зүйлээс хамаарч) | Бүрэн уртын харьцаа＞70% Чанарын дундаж оноо: Q10
|
Биоинформатикийн шинжилгээ
●Түүхий өгөгдөл боловсруулах
● Бичлэгийн тодорхойлолт
● Альтернатив залгах
● Генийн түвшин болон изоформын түвшинд илэрхийллийн тоон үзүүлэлт
● Дифференциал илэрхийллийн шинжилгээ
● Функцийн тэмдэглэгээ ба баяжуулалт (DEG болон DET)
Дээжийн шаардлага ба хүргэлт
Загвар шаардлага:
Нуклеотидууд:
| Конц.(нг/мкл) | Хэмжээ (мкг) | Цэвэр байдал | Шударга байдал |
| ≥ 100 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Гель дээр уураг, ДНХ-ийн бохирдол хязгаарлагдмал эсвэл огт байхгүй. | Ургамлын хувьд: RIN≥7.0; Амьтны хувьд: RIN≥7.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; хязгаарлагдмал буюу үндсэн өндөргүй |
Эд: Жин (хуурай): ≥1 гр
*5 мг-аас бага хэмжээтэй эдэд бид хөлдөөсөн (шингэн азотын) эдийн дээжийг илгээхийг зөвлөж байна.
Эсийн суспенз: Эсийн тоо = 3×106- 1×107
* Бид хөлдөөсөн эсийн лизатыг тээвэрлэхийг зөвлөж байна.Энэ эсийн тоо 5×10-аас бага байвал5, шингэн азотоор хөлдөөсөн флаш хийхийг зөвлөдөг бөгөөд энэ нь бичил олборлолтод илүү тохиромжтой.
Цусны дээж: Эзлэхүүн≥1 мл
Санал болгож буй дээжийн хүргэлт
Сав: 2 мл центрифугийн хоолой (цагаан тугалган цаас хэрэглэхийг зөвлөдөггүй)
Загварын шошго: Бүлэг+хуулбар, жишээ нь A1, A2, A3;B1, B2, B3 ... ...
Тээвэрлэлт: 2、Хуурай мөс: Дээжийг уутанд хийж хуурай мөсөнд булах шаардлагатай.
- RNAstable хоолой: РНХ-ийн дээжийг РНХ тогтворжуулах хоолойд (жишээ нь RNAstable®) хатааж, өрөөний температурт тээвэрлэж болно.
Үйлчилгээний ажлын урсгал
Нуклеотидууд:
Дээж хүргэх
Номын сангийн барилга
Дараалал
Мэдээллийн дүн шинжилгээ хийх
Борлуулалтын дараах үйлчилгээ
Үйлчилгээний ажлын урсгал
Эд:
Туршилтын загвар
Дээж хүргэх
РНХ олборлолт
Номын сангийн барилга
Дараалал
Мэдээллийн дүн шинжилгээ хийх
Борлуулалтын дараах үйлчилгээ
1.Дифференциал илэрхийллийн шинжилгээ - Галт уулын талбай
Дифференциал экспрессийн шинжилгээг генийн түвшинд хоёуланд нь боловсруулж, ялгавартай илэрхийлэгдсэн генийг (DEGs) ялгахын тулд изоформын түвшинд хийж болно.
илэрхийлсэн хуулбар (DETs)
2.Шаталсан кластерын дулааны зураг
3.Алтернатив залгах таних, ангилах
Таван төрлийн өөр залгах үйл явдлыг Astalavista урьдчилан таамаглаж болно.
4.Альтернатив поли-адениляцийн (APA) үйл явдлыг тодорхойлох, поли-А-аас дээш 50 bp дээр Motif
BMK хэрэг
Нанопорын бүрэн хэмжээний транскриптомын дарааллаар залгах өөр таних болон изоформын түвшний хэмжигдэхүүн
Нийтэлсэн:Байгалийн харилцаа холбоо, 2020
Дараалсан стратеги:
Бүлэглэх: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(K700E мутаци);3. Хэвийн В эсүүд
Дарааллын стратеги: MinION 2D номын сангийн дараалал, PromethION 1D номын сангийн дараалал;ижил дээжээс авсан богино хугацааны өгөгдлийг унших
Дараалсан платформ: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Гол үр дүн
1.Изоформын түвшний Альтернатив залгалтыг тодорхойлох
Удаан уншсан дараалал нь мутант SF3B1-ийг тодорхойлох боломжийг олгодогK700E- изоформын түвшинд залгах газрууд өөрчлөгдсөн.35 өөр 3′SS ба 10 өөр 5′SS нь SF3B1-ийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаатай байсан нь тогтоогдсон.K700Eболон SF3B1WT.35 өөрчлөлтийн 33-ыг нь удаан уншсан дарааллаар шинээр илрүүлсэн.
2.Изоформын түвшний Alternative Splicing хэмжигдэхүүн
SF3B1 дэх интрон хадгалах (IR) изоформын илэрхийлэлK700Eболон SF3B1WTSF3B1 дэх IR изоформын дэлхийн бууралтын зохицуулалтыг нанопорын дараалалд үндэслэн хэмжсэн.K700E.
Лавлагаа
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Архаг лимфоцитын лейкемийн SF3B1 мутацийн бүрэн хэмжээний транскриптийн шинж чанар нь хадгалагдсан интрон [J]-ийн бууралтыг илрүүлдэг.Байгалийн харилцаа холбоо.
