Бүрэн хэмжээний мРНХ-ийн дараалал - PacBio
Үйлчилгээний давуу тал
● Бүрэн хэмжээний cDNA молекулыг 3' төгсгөлөөс 5' төгсгөл хүртэл шууд унших
● Дарааллын бүтэц дэх изо хэлбэрийн түвшний нарийвчлал
● Өндөр нарийвчлалтай, бүрэн бүтэн хуулбарласан хуулбарууд
● Янз бүрийн төрөл зүйлд маш сайн нийцдэг
● 4 PacBio Sequel II дарааллын платформ бүхий том дарааллын хүчин чадалтай
● Pacbio-д суурилсан РНХ-ийн дараалал тогтоох 700 гаруй төсөл дээр өндөр туршлагатай
● BMKCloud-д суурилсан үр дүнг хүргэх: Платформ дээр тохируулсан өгөгдөл олборлох боломжтой.
● Төсөл дууссанаас хойш 3 сарын хугацаанд хүчинтэй борлуулалтын дараах үйлчилгээ
Үйлчилгээний үзүүлэлтүүд
Платформ: PacBio Sequel II
Дараалсан номын сан: Поли А-аар баяжуулсан мРНХ номын сан
Санал болгож буй өгөгдлийн гарц: 20 Гб/дээж (Зүйлээс хамаарч)
FLNC（%）: ≥75%
*FLNC: Бүрэн урт химер бус трансциптууд
Биоинформатикийн шинжилгээ
● Түүхий өгөгдөл боловсруулах
● Бичлэгийн тодорхойлолт
● Дарааллын бүтэц
● Илэрхийллийн тоон үзүүлэлт
● Функцийн тайлбар
Дээжийн шаардлага ба хүргэлт
Загвар шаардлага:
Нуклеотидууд:
| Конц.(нг/мкл) | Хэмжээ (мкг) | Цэвэр байдал | Шударга байдал |
| ≥ 120 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Гель дээр уураг, ДНХ-ийн бохирдол хязгаарлагдмал эсвэл огт байхгүй. | Ургамлын хувьд: RIN≥7.5; Амьтны хувьд: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; хязгаарлагдмал буюу үндсэн өндөргүй |
Эд: Жин (хуурай):≥1 гр
*5 мг-аас бага хэмжээтэй эдэд бид хөлдөөсөн (шингэн азотын) эдийн дээжийг илгээхийг зөвлөж байна.
Эсийн суспенз:Эсийн тоо = 3×106- 1×107
* Бид хөлдөөсөн эсийн лизатыг тээвэрлэхийг зөвлөж байна.Энэ эсийн тоо 5×10-аас бага байвал5, шингэн азотоор хөлдөөсөн флаш хийхийг зөвлөдөг бөгөөд энэ нь бичил олборлолтод илүү тохиромжтой.
Цусны дээж:Эзлэхүүн≥1 мл
Бичил биетэн:Масс ≥ 1 г
Санал болгож буй дээжийн хүргэлт
Контейнер:
2 мл центрифугийн хоолой (цагаан тугалган цаас хэрэглэхийг зөвлөдөггүй)
Загварын шошго: Бүлэг+хуулбар, жишээ нь A1, A2, A3;B1, B2, B3 ... ...
Хүргэлт:
1. Хуурай мөс: Дээжийг уутанд хийж хуурай мөсөнд булах шаардлагатай.
2. RNAstable хоолой: РНХ-ийн дээжийг РНХ тогтворжуулах хоолойд (жишээ нь RNAstable®) хатааж, өрөөний температурт тээвэрлэж болно.
Үйлчилгээний ажлын урсгал
Туршилтын загвар
Дээж хүргэх
РНХ олборлолт
Номын сангийн барилга
Дараалал
Мэдээллийн дүн шинжилгээ хийх
Борлуулалтын дараах үйлчилгээ
1.FLNC уртын хуваарилалт
Бүрэн хэмжээний химерик бус уншлагын урт (FLNC) нь номын сангийн барилгын cDNA-ийн уртыг илэрхийлдэг.FLNC уртын хуваарилалт нь номын сангийн барилгын чанарыг үнэлэх чухал үзүүлэлт юм.
FLNC унших уртын хуваарилалт
2.Бүрэн ORF бүсийн уртын хуваарилалт
Бид TransDecoder ашиглан уургийн кодчиллын бүс нутаг болон холбогдох амин хүчлийн дарааллыг урьдчилан таамаглахад ашигладаг бөгөөд бүх дээжинд нэмэлт бус транскриптийн мэдээллийг агуулсан унигений багцыг үүсгэдэг.
ORF бүсийн уртын бүрэн хуваарилалт
3.KEGG замын баяжуулалтын шинжилгээ
Дифференциалаар илэрхийлэгдсэн транскриптийг (DETs) PacBio дарааллын өгөгдлөөр үүсгэгдсэн бүрэн хэмжээний транскриптийн багц дээр NGS-д суурилсан РНХ дарааллын өгөгдлийг зэрэгцүүлэх замаар тодорхойлж болно.Эдгээр DET-ийг янз бүрийн функциональ шинжилгээнд зориулж боловсруулж болно, тухайлбал KEGG замын баяжуулалтын шинжилгээ.
DET KEGG зам баяжуулах -Цэг зураг
BMK хэрэг
Populus ишний транскриптомын хөгжлийн динамик
Нийтэлсэн: Ургамлын биотехнологийн сэтгүүл, 2019 он
Дараалсан стратеги:
Дээж цуглуулга:ишний бүсүүд: орой, эхний завсрын зангилаа(IN1), хоёр дахь зангилаа(IN2), гурав дахь зангилаа(IN3), завсрын зангилаа(IN4) ба зангилаа(IN5) Nanlin895
NGS дараалал:15 хүний РНХ-г нэг биологийн дээж болгон нэгтгэсэн.Цэг бүрийн биологийн гурван хуулбарыг NGS дараалалд зориулж боловсруулсан
TGS дараалал:Ишний бүсүүдийг орой, IN1-IN3, IN4-IN5 гэсэн гурван бүсэд хуваасан.Бүс бүрийг 0-1 кб, 1-2 кб, 2-3 кб, 3-10 кб гэсэн дөрвөн төрлийн номын сан бүхий PacBio дараалалд зориулж боловсруулсан.
Гол үр дүн
1.Нийт 87150 бүрэн хэмжээний хуулбар тогтоогдсон бөгөөд үүнд 2081 шинэ изоформ, 62058 шинэ хувилбар холбосон изоформ тодорхойлогдсон.
2.1187 lncRNA болон 356 нэгдэх генийг тодорхойлсон.
3.Анхдагч өсөлтөөс хоёрдогч өсөлт хүртэл 995 ялгавартай генээс 15838 ялгах транскриптийг илрүүлсэн.Бүх DEG-д 1216 нь транскрипцийн хүчин зүйл байсан бөгөөд ихэнх нь хараахан мэдэгдээгүй байна.
4.GO баяжуулалтын шинжилгээ нь анхдагч болон хоёрдогч өсөлтөд эсийн хуваагдал, исэлдэлт-багарах үйл явцын ач холбогдлыг илрүүлсэн.
Альтернатив залгах үйл явдлууд болон өөр өөр изоформууд
Транскрипцийн хүчин зүйлсийн талаархи WGCNA шинжилгээ
Лавлагаа
Чао К, Гао ЗФ, Жан Д, нар.Populus ишний транскриптомын хөгжлийн динамик.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi: 10.1111/pbi.12958
