ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ്
പ്രകൃതി
ആശയവിനിമയങ്ങൾ
ക്രോണിക് ലിംഫോസൈറ്റിക് ലുക്കീമിയയിലെ SF3B1 മ്യൂട്ടേഷന്റെ പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് സ്വഭാവം നിലനിർത്തിയിരിക്കുന്ന ഇൻട്രോണുകളുടെ നിയന്ത്രണം കുറയ്ക്കുന്നു
മുഴുനീള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ|നാനോപോർ സീക്വൻസിങ്|ഇതര ഐസോഫോം വിശകലനം
പശ്ചാത്തലം
Sസ്പ്ലിസിംഗ് ഫാക്ടർ SF3B1-ലെ ഓമാറ്റിക് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ, ക്രോണിക് ലിംഫോസൈറ്റിക് ലുക്കീമിയ(CLL), യുവൽ മെലനോമ, സ്തനാർബുദം മുതലായവ ഉൾപ്പെടെയുള്ള വിവിധ അർബുദങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതായി വ്യാപകമായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. കൂടാതെ, ഹ്രസ്വ-വായന ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക് പഠനങ്ങൾ SF3B1 മ്യൂട്ടേഷനുകൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന വ്യതിചലന പാറ്റേണുകൾ വെളിപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, ഈ ഇതര സ്പ്ലിസിംഗ് പാറ്റേണുകളെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനങ്ങൾ ഇവന്റ്-ലെവലിലേക്കും ഐസോഫോം-ലെവലിനെക്കുറിച്ചുള്ള അറിവില്ലായ്മയിലേക്കും പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, കാരണം ഹ്രസ്വ-വായന കൂട്ടിച്ചേർത്ത ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ പരിമിതി കാരണം.ഇവിടെ, മുഴുനീള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനായി നാനോപോർ സീക്വൻസിംഗ് പ്ലാറ്റ്ഫോം അവതരിപ്പിച്ചു, ഇത് AS ഐസോഫോമുകളിൽ ഇൻവെർസ്റ്റിഗേഷനെ ശക്തിപ്പെടുത്തി.
പരീക്ഷണ രൂപകല്പന
പരീക്ഷണങ്ങൾ
ഗ്രൂപ്പിംഗ്:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E മ്യൂട്ടേഷൻ);3. സാധാരണ ബി-കോശങ്ങൾ
ക്രമപ്പെടുത്തൽ തന്ത്രം:MinION 2D ലൈബ്രറി സീക്വൻസിംഗ്, PromethION 1D ലൈബ്രറി സീക്വൻസിംഗ്;ഒരേ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്നുള്ള ഹ്രസ്വ-വായന ഡാറ്റ
സീക്വൻസിങ് പ്ലാറ്റ്ഫോം:ONT മിനിയൺ;ONT PromethION;
ബയോ ഇൻഫോർമാറ്റിക് അനാലിസിസ്
![ചിത്രം1](https://www.bmkgene.com/uploads/FIG1.jpg)
ഫലം
എ6 CLL സാമ്പിളുകളിൽ നിന്നും 3 B-സെല്ലുകളിൽ നിന്നും 257 ദശലക്ഷം റീഡുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു.ഈ വായനകളിൽ ശരാശരി 30.5% മുഴുനീള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു.
Fഉയർന്ന ആത്മവിശ്വാസമുള്ള ഒരു കൂട്ടം ഐസോഫോമുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനായി ആർഎൻഎയുടെ (FLAIR) മുഴുനീള ഇതര ഐസോഫോം വിശകലനം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു.FLAIR ഇങ്ങനെ സംഗ്രഹിക്കാം:
Nഅനോപോർ വിന്യാസം വായിക്കുന്നു: റഫറൻസ് ജീനോമിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി പൊതുവായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ഘടന തിരിച്ചറിയുക;
Splice ജംഗ്ഷൻ തിരുത്തൽ: വ്യാഖ്യാനിച്ച ഇൻട്രോണുകളിൽ നിന്നുള്ള സ്പ്ലൈസ് സൈറ്റിനൊപ്പം ശരിയായ ക്രമത്തിലെ പിശകുകൾ (ചുവപ്പ്), ഷോർട്ട് റീഡ് ഡാറ്റയിൽ നിന്നുള്ള ഇൻട്രോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ രണ്ടും;
Collapse: splice junction chains (ഫസ്റ്റ്-പാസ് സെറ്റ്) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പ്രതിനിധി ഐസോഫോമുകൾ സംഗ്രഹിക്കുക.പിന്തുണയ്ക്കുന്ന വായനകളുടെ എണ്ണത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ഉയർന്ന ആത്മവിശ്വാസം ഐസോഫ്രോം തിരഞ്ഞെടുക്കുക (പരിധി: 3).
![ചിത്രം2](https://www.bmkgene.com/uploads/FIG2.jpg)
ചിത്രം 1. CLL-ലെ SF3B1 മ്യൂട്ടേഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മുഴുവൻ-ലെന്ത് ഐസോഫോമുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള FLAIR വിശകലനം
FLAIR 326,699 ഉയർന്ന ആത്മവിശ്വാസമുള്ള സ്പ്ലൈസ്ഡ് ഐസോഫോമുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അതിൽ 90% പുതിയ ഐസോഫോമുകളാണ്.ഈ വിവരിക്കാത്ത ഐസോഫോമുകളിൽ ഭൂരിഭാഗവും അറിയപ്പെടുന്ന സ്പ്ലൈസ് ജംഗ്ഷനുകളുടെ (142,971) പുതിയ കോമ്പിനേഷനുകളാണെന്ന് കണ്ടെത്തി, ബാക്കിയുള്ള നോവൽ ഐസോഫോമുകളിൽ നിലനിർത്തിയ ഇൻട്രോൺ (21,700) അല്ലെങ്കിൽ നോവൽ എക്സോൺ (3594) അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.
Lഓംഗ്-റീഡ് സീക്വൻസുകൾ ഐസോഫോം തലത്തിൽ മ്യൂട്ടന്റ് SF3B1-K700E -മാറ്റപ്പെട്ട സ്പ്ലൈസ് സൈറ്റുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ പ്രാപ്തമാക്കുന്നു.35 ഇതര 3'SS-കളും 10 ഇതര 5'SS-കളും SF3B1-K700E, SF3B1-WT എന്നിവയ്ക്കിടയിൽ കാര്യമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതായി കണ്ടെത്തി.35 മാറ്റങ്ങളിൽ 33 എണ്ണവും ദീർഘനേരം വായിച്ച ക്രമങ്ങൾ വഴി പുതിയതായി കണ്ടെത്തി.നാനോപോർ ഡാറ്റയിൽ, SF3B1-K700E-മാറ്റം വരുത്തിയ 3'SS-കൾ തമ്മിലുള്ള കാനോനിക്കൽ സൈറ്റുകളുടെ കൊടുമുടികളിലേക്കുള്ള ദൂരം ഏകദേശം -20 bp ആണ്, ഇത് CLL ഷോർട്ട്-റീഡ് സീക്വൻസുകളിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തതിന് സമാനമായ ഒരു നിയന്ത്രണ വിതരണത്തിൽ നിന്ന് കാര്യമായ വ്യത്യാസമുണ്ട്.ERGIC3 ജീനിന്റെ ഐസോഫോമുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു, അവിടെ പ്രോക്സിമൽ സ്പ്ലൈസ് സൈറ്റ് അടങ്ങിയ ഒരു പുതിയ ഐസോഫോം SF3B1-K700E യിൽ കൂടുതൽ ധാരാളമായി കണ്ടെത്തി.പ്രോക്സിമൽ, ഡിസ്റ്റൽ 3'SS എന്നിവ ഒന്നിലധികം ഐസോഫോമുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്ന വ്യതിരിക്തമായ AS പാറ്റേണുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.
![ചിത്രം3](https://www.bmkgene.com/uploads/FIG3.jpg)
![ചിത്രം 4](https://www.bmkgene.com/uploads/FIG4.jpg)
ചിത്രം 2. നാനോപോർ സീക്വൻസിംഗ് ഡാറ്റ ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഇതര 3′ സ്പ്ലിസിംഗ് പാറ്റേണുകൾ
ഐആർ ഐഡന്റിഫിക്കേഷനിലും ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനിലുമുള്ള ആത്മവിശ്വാസം കാരണം ഹ്രസ്വ-വായന അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വിശകലനത്തിൽ ഐആർ ഇവന്റ് ഉപയോഗ വിശകലനം വളരെക്കാലമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു.SF3B1-K700E, SF3B1-WT എന്നിവയിലെ IR ഐസോഫോമുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ നാനോപോർ സീക്വൻസുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി കണക്കാക്കി, SF3B1-K700E-ലെ ഐആർ ഐസോഫോമുകളുടെ ആഗോള നിയന്ത്രണം വെളിപ്പെടുത്തുന്നു.
ചിത്രം 4. കാർഷിക തീവ്രതയും നെറ്റ്വർക്ക് കണക്റ്റിവിറ്റിയും മൂന്ന് കാർഷിക സംവിധാനങ്ങളിലുടനീളം (എയും ബിയും);റാൻഡം ഫോറസ്റ്റ് അനാലിസിസ് (സി) കാർഷിക തീവ്രതയും എഎംഎഫ് കോളനിവൽക്കരണവും (ഡി) തമ്മിലുള്ള ബന്ധം
![ചിത്രം 5](https://www.bmkgene.com/uploads/FIG5.jpg)
ചിത്രം 3. CLL SF3B1-K700E-ൽ ഇൻട്രോൺ റെന്റൻഷൻ ഇവന്റുകൾ കൂടുതൽ ശക്തമായി കുറയ്ക്കുന്നു
സാങ്കേതികവിദ്യ
നാനോപോർ ലോംഗ്-റീഡ് സീക്വൻസിങ്
Nഅനോപോർ സീക്വൻസിംഗ് എന്നത് ഒരു തന്മാത്ര തത്സമയ വൈദ്യുത സിഗ്നൽ സീക്വൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യയാണ്.
Dഇരുവശങ്ങളുള്ള ഡിഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ, ബയോഫിലിമിൽ ഉൾച്ചേർത്ത നാനോപോറസ് പ്രോട്ടീനുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും മോട്ടോർ പ്രോട്ടീന്റെ ലീഡിന് കീഴിൽ അഴിച്ചുമാറ്റുകയും ചെയ്യും.
DNA/RNA സ്ട്രോണ്ടുകൾ വോൾട്ടേജ് വ്യത്യാസത്തിന്റെ പ്രവർത്തനത്തിൽ നിശ്ചിത നിരക്കിൽ നാനോപോർ ചാനൽ പ്രോട്ടീനിലൂടെ കടന്നുപോകുന്നു.
Mരാസഘടനയനുസരിച്ച് ഒലികുലുകൾ വ്യത്യസ്ത വൈദ്യുത സിഗ്നലുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നു.
Rബേസ് കോളിംഗ് വഴിയാണ് സീക്വൻസുകളുടെ തത്സമയ കണ്ടെത്തൽ.
![ചിത്രം6](https://www.bmkgene.com/uploads/fig6.jpg)
മുഴുനീള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് സീക്വൻസിംഗിന്റെ പ്രകടനം
√ ഡാറ്റ സാച്ചുറേഷൻ
![ചിത്രം7](https://www.bmkgene.com/uploads/fig7.jpg)
താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്ന ഡാറ്റ സാച്ചുറേഷൻ എത്താൻ 7 മടങ്ങ് കുറച്ച് റീഡുകൾ ആവശ്യമാണ്.
√ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് സ്ട്രക്ചർ ഐഡന്റിഫിക്കേഷൻ
![ചിത്രം8](https://www.bmkgene.com/uploads/fig8.jpg)
ഓരോ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിന്റെയും സമവായ പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള വായനയിലൂടെ വൈവിധ്യമാർന്ന ഘടനാപരമായ വേരിയന്റുകളുടെ തിരിച്ചറിയൽ
√ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ്-ലെവൽ ഡിഫറൻഷ്യൽ അനാലിസിസ് - ഷോർട്ട് റീഡുകളാൽ മറഞ്ഞിരിക്കുന്ന മാറ്റങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തുക
![ചിത്രം9](https://www.bmkgene.com/uploads/fig9.jpg)
റഫറൻസ്
ടാങ് എഡി, സോലെറ്റ് സിഎം, ബാരെൻ എംജെവി, തുടങ്ങിയവർ.ക്രോണിക് ലിംഫോസൈറ്റിക് ലുക്കീമിയയിലെ SF3B1 മ്യൂട്ടേഷന്റെ പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് സ്വഭാവം നിലനിർത്തിയിരിക്കുന്ന ഇൻട്രോണുകളുടെ നിയന്ത്രണം കുറയ്ക്കുന്നു[J].പ്രകൃതി ആശയവിനിമയം.
സാങ്കേതികതയും ഹൈലൈറ്റുകളും വിവിധ റീസീച്ച് രംഗത്തെ വ്യത്യസ്ത ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് സീക്വൻസിങ് സാങ്കേതികവിദ്യകളുടെ ഏറ്റവും പുതിയ വിജയകരമായ പ്രയോഗവും പരീക്ഷണാത്മക രൂപകൽപ്പനയിലും ഡാറ്റാ മൈനിംഗിലുമുള്ള മികച്ച ആശയങ്ങളും പങ്കിടാൻ ലക്ഷ്യമിടുന്നു.
പോസ്റ്റ് സമയം: ജനുവരി-08-2022