МЕТАГЕНОМИКА
Целосни, затворени бактериски геноми од микробиоми со користење на секвенционирање на нанопори
Секвенционирање на нанопори |Метагеномика |MAGs |Циркуларизација на бактерискиот геном |Цревна микробиота
Определување
1. Во оваа студија беше претставен нов метод за екстракција на долги фрагменти од ДНК, со кој беше постигната екстракција на микрограм чиста, HMW ДНК погодна за долго читано секвенционирање од 300 mg столица
2. Во оваа студија беше воведен работен тек на склопување, Струг, каде што MAG беа составени со долги читања и коригирани со кратки отчитувања.
3. Струг беше оценет со лажна смеса.7 од 12 бактерии беа успешно составени во единечни контиги и 3 беа собрани во четири или помалку бактерии.
4. Струг дополнително беше применет на примероците на столицата, кои генерираа 20 циркуларизирани геноми, вклучувајќи ги Prevotella copri и кандидатот Cibiobacter sp., кои беа познати по тоа што беа богати со мобилни генетски елементи.
Главно достигнување
Протокол за екстракција за HWM DNA
Долго читаните цревни метагеномски студии засновани на секвенционирање долго време страдаат од цврстина при екстракција на ДНК со висока молекуларна тежина (HMW) од столицата.Во оваа студија, беше воведен протокол за екстракција базиран на ензими за да се избегне обемно стрижење со тепање на мониста во традиционални методи.Како што е прикажано на следната слика, примероците најпрво беа третирани со коктел од ензими, вклучително литички ензим, Метаполизим итн. за да се разградат клеточните ѕидови.Ослободената ДНК беше екстрахирана со системот фенол-хлороформ, проследено со дигестија на протеиназа К и RNase A, прочистување врз основа на колона и избор на големина на SPRI.Овој метод успеа да даде микрограми HMW ДНК од 300 m столица, што ги исполнува долго читаните барања за секвенционирање и во однос на квалитетот и квантитетот.
Слика 1. Шема за екстракција на ДНК на HWM
Шема проток на струг
Како што е опишано на следната слика, Струг содржи постоечки процес на сурово основно повикување со помош на Гупи.Два долго прочитани склопови потоа се произведуваат од Flye и Canu одделно проследени со откривање и отстранување на погрешно склопување.Двата под-склопа се споени со брзо спојување.По спојувањето, големите склопови на ниво на мегабаза потоа се проверуваат за циркуларизација.Последователно, консензуалното усовршување на овие склопови се обработува со кратки читања.Конечно собраните бактериски геноми се обработуваат за конечно откривање и отстранување на погрешно склопување.
Слика 2. Шема на проток на склопот на струг
Евалуација на струг со смеса од лажни бактерии
Стандардна ATCC 12-видови смеса која содржи и грам-позитивни и грам-негативни бактерии беше употребена за да се оцени ефикасноста на платформата за секвенционирање нанопори и Струг во склопот на MAG.Вкупно 30,3 Gb податоци беа генерирани од нанопорна платформа со N50 од 5,9 kb.Струг во голема мера го подобри склопот N50 до 1,6 до 4 пати во споредба со другите долгочитани алатки за склопување и 2 до 9 пати во споредба со хибридните алатки за склопување.Од 12 бактериски геноми, седум беа собрани во единечни контигми (Слика 3. Циркови со црна точка).Уште три беа собрани во четири или помалку контиги, во кои најнецелосното склопување содржеше 83% од геномот во еден контиг.
Слика 3. Геномски склопови во дефинирана бактериска смеса од 12 видови
Примена на струг во примероци од столица
Овој метод беше дополнително применет на примероци од човечка столица со цел да се спореди идентификацијата и склопувањето на организмот со постоечките методи, читање-облак и анализа базирана на кратко читање.Од трите вклучени примероци, новата екстракција базирана на ензими даде најмалку 1 μg на 300 mg влезна маса.Секвенционирањето на нанопорите на овие HMW ДНК генерира долги отчитувања со N50 од 4,7 kb, 3,0 kb и 3,0 kb соодветно.Имено, сегашниот метод покажа голем потенцијал во детекција на микроби во споредба со постоечките методи.Релативно повисока алфа разновидност на ниво на видови беше прикажана овде во споредба со кратко читање и читање-облак.Покрај тоа, сите родови од анализата на кратко читање, дури и типично грам-позитивните организми отпорни на лиза, беа обновени со овој метод.
Слика 4. Алфа разновидност и таксномски компоненти утврдени со методите Nanopore, кратко читање и читање-облак
Струг даде многу подолг целосен склоп N50 од склопот за кратко читање и читање-облак, и покрај три до шест пати помал внес на необработени податоци.Нацрт геномите беа произведени со континуирано врзување, во кое нацртите беа класифицирани на „висококвалитетни“ или „делумни“ врз основа на комплетноста, контаминацијата, основните гени од една копија, итн. за кратко читање и читање-облак.
Слика 5. Контигност на склопување по организам на секој метод
Покрај тоа, сегашниот пристап на склопување е способен да даде затворени, кружни геноми.Во примероците на столицата, беа собрани осум висококвалитетни геноми со еден контиг и пет од нив постигнаа прецизна циркуларизација.Долго прочитаниот пристап, исто така, покажа импресивен капацитет во решавањето на повторливите елементи во геномите.ЦиркуларизираноP. copriгеномот е генериран со овој пристап, за кој е познато дека содржи висок степен на повторување на секвенците.Најдоброто склопување на овој геном со кратко читање и читање-облак никогаш не го надминало N50 од 130 kb, дури и со длабочина на покриеност од 4800X.Овие елементи со голем број на копии беа целосно решени со пристапот на долго читање, кој често се наоѓа на точките на прекин на склоповите за кратко читање или читање-облак.Друг затворен геном беше пријавен во оваа студија, за кој се веруваше дека е член на неодамна опишаниотЦибиобактеријаклада.Во овој затворен состав беа идентификувани пет наводни фаги, кои се движат од 8,5 до 65,9 kb.
Слика 6. Циркос дијаграм на затворени геноми на P.copri и Cibiobacter sp.
Референца
Мос, ЕЛ, Магини, ДГ и Бат, АС (2020).Комплетни, затворени бактериски геноми од микробиоми со користење на секвенционирање на нанопори.Природна биотехнологија,38(6), 701-707.
Техника и Определување има за цел споделување на најновата успешна примена на различни технологии за секвенционирање со висок пропуст во различни истражувачки арени, како и брилијантни идеи за експериментален дизајн и ископување податоци.
Време на објавување: Јан-07-2022 година