ЧОВЕЧКА ГЕНОМИКА
генетика на природата
Долго прочитаното секвенционирање ги идентификува повторените експанзии на GGC во NOTCH2NLC поврзани со невронска интрануклеарна инклузивна болест
ONT ресеквенцирање |Илумина |Секвенционирање на цели егзоми |CRISPR-Cas9 ONT насочено секвенционирање |РНК-сек |ONT 5mC метилација повикување
Определување
1. Со анализа на поврзување на големо семејство NIID, беа идентификувани два поврзани региони.
2.ONT-базирано долго читано секвенционирање и Cas-9 посредувано збогатување ONT секвенционирање открија потенцијална генетска причина за NIID, GGC повторувачки експанзии во 5′ UTR на NOTCH2NLC.Оваа студија за прв пат објави повторени експанзии во гени специфични за човекот кои еволуирале преку сегментални дупликации.
3. Секвенционирањето на РНК откри абнормални транскрипти со антисенс на почетокот или внатре во регионите за повторување на експанзијата на GGC во NOTCH2NLC.
Позадина
Nевроналната интрануклеарна инклузивна болест (НИИД) е прогресивна и фатална невродегенеративна болест, која се карактеризира со присуство на еозинофилни хијалински интрануклеарни инклузии во централниот и периферниот нервен систем.Неговите многу променливи клинички манифестации предизвикуваат големи тешкотии во дијагнозата до воведувањето на биопсија на кожата.Сепак, методите базирани на хистопатологија сè уште страдаат од погрешна дијагноза, што бара генетско разбирање на NIID.
Достигнувања
Анализа на врски
SСеквенционирање на целиот геном (WGS) и секвенционирање на целиот егзом (WES) беше изведено на големо семејство NIID (13 засегнати и 7 незасегнати членови).Анализата на поврзаноста на SNPs извлечени од овие податоци откри само два поврзани региони: регион од 3,5 Mb на 1p36.31-p36.22 (максимум LOD=2.32) и регион од 58.1 Mb на 1p22.1-q21.3 (максимум LOD: 4.21 ).Сепак, не беа идентификувани патогени SNP или CNV во овие поврзани региони.
GGC ги повторува проширувањата во NOTCH2NLC
NСеквенционирањето засновано на анопори беше обработено на 13 засегнати и 4 незасегнати членови од 8 семејства (друг засегнат член беше секвенциониран со платформата за долго читање секвенционирање на Pacbio.).Долго прочитаните податоци открија проширувања на GGC поврзани со болеста во 5' UTR на мапирањето на генот NOTCH2NLC до 58,1 Mb поврзан регион (Слика 1).Овие повторливи проширувања беа исто така идентификувани во сите 40 спорадични NIID случаи тестирани со RP-PCR.
CКако-9 посредувано секвенционирање на цели на нанопорна платформа беше употребено за да се постигне поголемо покривање за читање на повторување NOTCH2NLC (100 X-1,795 X).Овие консензусни секвенци добро се согласија со претходните наоди за повторувачките проширувања на GGC.Покрај тоа, {(GGA)n (GGC)n}n повторувања беа идентификувани како потенцијален генетски маркер за фенотип доминантен во слабоста (Слика 2).
Слика 1. Повторено проширување поврзано со болеста идентификувано на егзонот 1 на изоформите NOTCH2NLC.
Слика 2. Консензусните секвенци на NPTCH2NLC се повторуваат кај пациенти со NIID со (*) или без фенотип доминантен со слабост
NГените OTCH2NL се гени специфични за човекот, за кои се верува дека играат витална улога во еволуцијата на човечкиот мозок и невролошките болести.Сепак, три гени поврзани со NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB и NOTCH2NLC) со >99,1% идентитет на секвенца не беа решени до најновото собрание на човечкиот геном.Без синтеза и долго читано секвенционирање на нанопорна платформа покажаа забележителни предности во решавањето на региони со голема сличност и (GGC)n повторувања со 100% богати со GC.
GGC ги повторува проширувањата во NOTCH2NLC
TСеквенционирањето на ранскриптом беше обработено на 2 засегнати и 2 незасегнати членови.Нормализираната длабочина на читање беше пресметана на сетилните и антисмислените нишки во спротиводно од првите егзони на паралозите NOTCH2NL.Абнормални анти-сензорни транскрипти беа пронајдени само во погодените случаи, кои се наоѓаат на почетокот или во внатрешноста на повторливиот експанзивен регион (виолетови врвови во F1-14 и F1-16 на слика 3.).Дополнително, беа идентификувани 54 DEG и сите беа збогатени со GO и MPO термини поврзани со невронските функции.
Слика 3. Нормализирана длабочина на читање нагоре од првиот егзон на NOTCH2NLC во незасегнати (горе) и засегнати (долу) случаи.
Технологија
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nанопорното секвенционирање се разликува од другите платформи за секвенционирање, со тоа што нуклеотидите се читаат директно без процес на синтеза на ДНК.Како што една нишка на ДНК поминува низ протеинска пора со нано големина (нанопора), различни нуклеотиди генерираат различни јонски струи, кои можат да се заробат и пренесат во низа бази.Самата платформа за секвенционирање ONT не покажува очигледна техничка граница за должината на читањето на ДНК.Затоа, ултра долгите отчитувања (ULR) се достапни за висококвалитетно склопување на геномот.Покрај тоа, овие екстремно долги читања, кои се доволно долги за да се вкрстат карактеристиките на сложената низа или структурните варијации, помагаат да се надминат ограничувањата на секвенционирањето на кратко читање овде.
Секвенционирање на нанопори
Идентификација на варијации на структурата (SV).
SСеквенционирањето без синтеза во голема мера ги зачува информациите за метилација на ДНК на шаблонот.Метилираните A, T, C и G генерираат различни јонски струи од неметилираните, кои може директно да се читаат од платформата.Секвенционирањето на нанопорите го поттикнува профилирањето на целиот геном и од 5 mC и 6 mA при резолуција од еден нуклеотид.
Референца
Јун Соне и др.ал.Долго прочитаното секвенционирање ги идентификува повторливите експанзии на GGC во NOTCH2NLC поврзани со болест на невронска интрануклеарна инклузија.Природа генетика (2019)
Техника и Определување има за цел споделување на најновата успешна примена на различни технологии за секвенционирање со висок пропуст во различни истражувачки арени, како и брилијантни идеи за експериментален дизајн и ископување податоци.
Време на објавување: јануари-06-2022 година