Te Whakaraupapa mRNA-Nanopore
Painga Ratonga
● rītaha raupapa iti
● Te whakaatu i nga ngota ngota cDNA roa-katoa
● He iti ake nga raraunga e hiahiatia ana kia rite te maha o nga tuhinga
● Te tautuhi i nga momo ahua maha mo ia ira
● Te inenga korero i roto i te taumata isoform
Whakatakotoranga Ratonga
| Whare Pukapuka | Paerewa | Tukunga raraunga e manakohia ana (Gb) | Mana Kounga |
| cDNA-PCR(Poly-A whakarangatira) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/tauira (Kei runga i nga momo) | ōwehenga roa-katoa＞70% Te kaute kounga toharite: Q10
|
Ko nga rangahau bioinformatics
●Tukatuka raraunga raw
● Tautuhi tuhinga
● Ko te hono atu
● Te inenga korero i te taumata ira me te taumata isoform
● Te tātari korero rerekee
● Tuhituhi mahi me te whakarangatira (DEG me DET)
Nga Whakaritenga Tauira me te Tukunga
Whakaritenga Tauira:
Nucleotides:
| Conc.(ng/μl) | Rahi (μg) | Maamaa | Te tapatahi |
| ≥ 100 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 He iti, karekau he pūmua, he poke DNA ranei e whakaatuhia ana i runga i te gel. | Mo nga tipu: RIN≥7.0; Mo nga kararehe: RIN≥7.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; he iti, he kore ranei te taumata teitei |
Kopa: Taumaha(maroke): ≥1 g
*Mo te kiko iti ake i te 5 mg, ka tūtohu kia tukuna mai he tauira kopa tio (i roto i te hau hauota wai).
Tārewa pūtau: Tatau pūtau = 3×106- 1×107
* Ka tūtohu matou ki te tuku lysate pūtau tio.Mena he iti ake te tatau o taua pūtau i te 5×105, ka tūtohuhia te flash tio i roto i te hauota wai, he pai ake mo te tangohanga moroiti.
Tauira toto: Volume≥1 ml
Tukunga Tauira Manakohia
Ipu: 2 ml ngongo centrifuge (Kāore i te tūtohutia te konumohe tine)
Tauira tapanga: Rōpū+whakaritea tauira A1, A2, A3;B1, B2, B3......
Tukunga: 2, Tio-maroke: Me whakakii nga tauira ki roto i nga peeke ka tanu ki roto i te huka-maroke.
- Nga ngongo RNAstable: Ka taea te whakamaroke i nga tauira RNA i roto i te ngongo whakapumau RNA(hei tauira, RNAstable®) ka tukuna ki te pāmahana rūma.
Te Rerenga Mahi Ratonga
Nucleotides:
Te tuku tauira
Te hanga whare pukapuka
Whakaraupapa
Te tātari raraunga
Nga ratonga muri-hoko
Te Rerenga Mahi Ratonga
Kopa:
Hoahoa whakamatautau
Te tuku tauira
tangohanga RNA
Te hanga whare pukapuka
Whakaraupapa
Te tātari raraunga
Nga ratonga muri-hoko
1.Te wetewete korero rereke -Te puia puia
Ka taea te tukatuka i te wetewete korero rerekee i roto i nga taumata ira e rua hei tautuhi i nga ira rerekee (DEG) me te taumata isoform hei tautuhi rerekee.
tuhinga tuhi (DET)
2.Mahere wera whakarōpūtanga aroākapa
3.Alternative splicing identification and classification
E rima nga momo o nga huihuinga honohono rereke ka taea e Astalavista te matapae.
4.Ko etahi atu takahanga poly-adenylation (APA) te tautuhi me te Motif i te 50 bp whakarunga o te poly-A
Take BMK
Ko te tautuhi taapiri rereke me te ine taumata-isoform ma te nanopore raupapa tuhinga roa-katoa
Whakaputaina:Whakawhitiwhiti Nature,2020
Rautaki raupapa:
Whakarōpū: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(K700E whakarerekētanga);3. Pūtau B noa
Rautaki raupapa: Te raupapatanga whare pukapuka MinION 2D, PromethION 1D raupapa pukapuka;nga raraunga panui poto mai i nga tauira ano
Te raupapa raupapa: Nanopore Minion;Nanopore PromethION;
Nga hua matua
1.Isoform-level Alternative Splicing Identification
Ko nga raupapa panui-roa ka whakamanahia te tautuhi i te mutant SF3B1K700E-i whakarereke i nga waahi hono i te taumata-isoform.E 35 nga momo 3'SS me te 10 nga momo 5'SS i kitea he tino rereke te hono i waenga i te SF3B1K700Eme te SF3B1WT.33 o nga whakarereketanga 35 i kitea hou e nga raupapa panui-roa.
2.Isoform-level Alternative Splicing quantification
Whakaaturanga o te pupuri intron(IR) isoforms i SF3B1K700Eme te SF3B1WTi inehia i runga i nga raupapa nanopore, e whakaatu ana i te ture-a-ao mo nga IR isoforms i SF3B1K700E.
Tohutoro
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Ko te ahua o te tuhinga roa mo te whakarereketanga o te SF3B1 i roto i te leukemia lymphocytic tawhito e whakaatu ana i te whakahekenga o nga introns [J].Whakawhitiwhiti Nature.
