METAGENOMICS
Genome bakteria feno sy mihidy avy amin'ny microbiome mampiasa filaharana nanopore
Nanopore Sequencing |Metagenomics |MAGs |Famaritana ny génome bakteria |Microbiota tsinay
Zava-nisongadina
1. Nisy fomba vaovao hanesorana ireo sombintsombiny lava amin'ny ADN naseho tamin'ity fanadihadiana ity, izay nahitana ny fitrandrahana micrograma madio, HMW ADN mety ho an'ny filaharana efa ela be avy amin'ny 300 mg ny fivalanana.
2. Nisy fivorian'ny fivoriambe, Lathe, nampidirina tao amin'ity fandalinana ity, izay nanangona ny MAGs tamin'ny famakiana lava ary nanitsy tamin'ny famakiana fohy.
3. Ny lathe dia nodinihina tamin'ny fampifangaroana maneso.Ny bakteria 7 amin'ny 12 dia natambatra ho contigs tokana ary ny 3 dia natambatra ho contigs efatra na latsaka.
4. Ny lathe dia nampiharina bebe kokoa tamin'ny santionan'ny fivalanana, izay niteraka génome 20 mihodidina, anisan'izany ny Prevotella copri sy ny kandida Cibiobacter sp., izay nalaza ho manankarena amin'ny singa fototarazo finday.
Zava-bita lehibe
Protokol fitrandrahana ho an'ny ADN HWM
Ny fandalinana metagenomika amin'ny tsinainy mifototra amin'ny filaharana lava be dia efa nijaly noho ny hamafin'ny fakana ny ADN lanja molekiola avo (HMW) avy amin'ny fivalanana.Ao anatin'ity fandalinana ity, nisy protocole fitrandrahana mifototra amin'ny enzyme dia nampidirina mba hialana amin'ny fanetezana be dia be amin'ny fikapohana vakana amin'ny fomba nentim-paharazana.Araka ny asehon'ity sary manaraka ity, ny santionany dia nokarakaraina voalohany tamin'ny cocktail misy enzymes, anisan'izany ny enzyme lytika, MetaPolyzyme, sns. mba hanimba ny rindrin'ny sela.Ny ADN navoaka dia nalaina tamin'ny rafitra Phenol-chloroform, arahin'ny Proteinase K sy RNase A fandevonan-kanina, fanadiovana mifototra amin'ny tsanganana ary fifantenana ny haben'ny SPRI.Ity fomba ity dia nahavita namoaka micrograms an'ny ADN HMW avy amin'ny 300 m amin'ny fivalanana, izay mahafeno ny fepetra takian'ny filaharan'ny famakiana lava be eo amin'ny kalitao sy ny habeny.
Sary 1. Tetika fitrandrahana ADN HWM
Scheme flow of Lathe
Araka ny voalaza eto amin'ity sary manaraka ity, ny Lathe dia misy dingana efa misy amin'ny fizotry ny antso an-tariby manta mampiasa Guppy.Fivoriambe roa novakiana lava dia novokarin'i Flye sy Canu misaraka arahin'ny fisavana sy fanesorana diso.Atambatra amin'ny quickmerge ireo zana-assembly roa.Aorian'ny fampifangaroana, ny fivoriambe lehibe amin'ny haavon'ny megabase dia hojerena ho an'ny circularization.Aorian'izay, ny fanitsiana marimaritra iraisana momba ireo fivoriambe ireo dia karakaraina amin'ny famakiana fohy.Ny fototarazon'ny bakteria miangona farany dia karakaraina mba hahitana sy hanesorana ny fivoriany farany.
Sary 2. Fikojakojana ny rafitra lathe
Fanombanana ny lathe miaraka amin'ny fangaro bakteria maneso
Ny fangaro ATCC 12-species mahazatra misy bakteria Gram-positive sy Gram-negative dia nampiasaina hanombanana ny fahombiazan'ny sehatra sequencing nanopore sy Lathe amin'ny fivoriambe MAG.Ny totalin'ny angona 30.3 Gb dia novokarin'ny sehatra nanopore miaraka amin'ny N50 amin'ny 5.9 kb.Ny lathe dia nanatsara ny fivoriambe N50 ka hatramin'ny 1.6 ka hatramin'ny in-4 raha ampitahaina amin'ny fitaovana famoriam-bahoaka efa ela novakiana ary 2 hatramin'ny 9 heny raha oharina amin'ny fitaovana fivoriambe hybridd.Amin'ny génome bakteria 12, fito no natambatra ho contigs tokana (sary 3. Circos misy teboka mainty).Telo hafa no natambatra ho contigs efatra na latsaka, izay nahitana ny 83%-n'ny genome ao anaty contig tokana ny fivoriambe tsy feno indrindra.
Sary 3. Fivoriambe genome ao anaty fifangaroan'ny bakteria misy karazana 12 voafaritra
Fampiharana ny Lathe amin'ny santionany amin'ny tavy
Ity fomba ity dia nampiharina bebe kokoa tamin'ny santionan'ny tain'olombelona mba hampitahana ny famantarana ny zavamananaina sy ny fivondronan'ny fivoriambe amin'ny fomba efa misy, famakiana rahona ary fandalinana mifototra amin'ny famakiana fohy.Avy amin'ireo santionany telo voarohirohy, ny fitrandrahana anzima vaovao dia namokatra farafahakeliny 1 μg isaky ny 300 mg ny faobe fampidirana.Ny fizotry ny nanopore an'ireo ADN HMW ireo dia niteraka famakiana lava miaraka amin'ny N50 amin'ny 4.7 kb, 3.0kb ary 3.0kb tsirairay avy.Marihina fa ny fomba ankehitriny dia nampiseho hery lehibe amin'ny fitiliana mikraoba raha oharina amin'ny fomba efa nisy.Naseho eto ny fahasamihafan'ny karazana alfa avo kokoa raha oharina amin'ny vakiteny fohy sy rahona vakiana.Ambonin'izany, ny genera rehetra avy amin'ny famakafakana fohy novakiana, eny fa na dia ireo zavamananaina Gram-positive mahatohitra lysis aza, dia naverina tamin'ny alalan'ity fomba ity.
Sary 4. Ny fahasamihafan'ny alfa sy ny singam-panjakan'ny hetra voafaritry ny Nanopore, fomba famakiana fohy sy famakiana rahona
Ny lathe dia nanome N50 fivondronana manontolo lava kokoa noho ny fivorian'ny vakiteny fohy sy vakiana rahona, na dia eo aza ny fampidiran'ny angona manta avo telo heny ka hatramin'ny enina.Ny fototarazo drafitra dia novokarina tamin'ny contig binning, izay nanasokajiana ny drafitra ho "avo ny kalitao" na "ampahany" mifototra amin'ny fahafenoana, ny loto, ny fototarazo fototra tokana, sns. ho mamaky fohy sy mamaky rahona.
Sary 5. Fivoriambe isan-karazany amin'ny fomba tsirairay
Fanampin'izany, ny fomba fiasa amin'izao fotoana izao dia afaka manome génome mihidy sy boribory.Ao amin'ny santionan'ny fivalanana dia nisy génomika valo avo lenta, tokana contig, ary ny dimy amin'ireo dia nahavita circularization percise.Ny fomba famakiana lava be dia nampiseho fahaiza-manao mahavariana amin'ny famahana ireo singa miverimberina ao amin'ny génome.CircularizedP. copriNy fototarazo dia novokarin'ity fomba ity, izay fantatra fa misy famerimberenan'ny filaharana avo lenta.Ny fivoriambe tsara indrindra amin'ity génome ity amin'ny famakiana fohy sy famakiana rahona dia tsy mihoatra ny N50 amin'ny 130 kb, na dia amin'ny halalin'ny fandrakofana 4800X aza.Ireo singa isa avo dika mitovy ireo dia voavaha tanteraka tamin'ny alàlan'ny fomba famakiana lava be, izay matetika hita any amin'ireo teboka tapaka amin'ny fivoriambe fohy mamaky na mamaky rahona.Gnome mihidy iray hafa no notaterina tamin'ity fanadihadiana ity, izay heverina fa mpikambana vao haingana nofaritanaCibiobacterclade.Dimy putative phage no fantatra tamin'ity fivoriambe mihidy ity, manomboka amin'ny 8.5 ka hatramin'ny 65.9 kb.
Sary 6. Diagrama Circos momba ny génome mihidy an'ny P.copri sy Cibiobacter sp.
Reference
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Genome bakteria feno sy mihidy avy amin'ny microbiome mampiasa filaharana nanopore.Nature biotechnologie,38(6), 701-707.
Teknolojia sy zava-nisongadina mikendry ny hizara ny fampiharana mahomby farany indrindra amin'ny teknolojia fandrefesana avo lenta amin'ny sehatra fikarohana isan-karazany ary koa hevitra mamiratra amin'ny famolavolana andrana sy fitrandrahana angona.
Fotoana fandefasana: Jan-07-2022