MRNA Sequencing-Nanopore feno
Tombontsoa amin'ny serivisy
● Mitongilana ambany
● Mampiseho molekiola cDNA feno
● Kely kokoa ny angona ilaina mba handrakofana ny isa mitovy
● Famantarana ny isoforme maromaro isaky ny fototarazo
● Famaritana ny fitenenana amin'ny haavon'ny isoform
Service Specifications
| -BOKIN'NY Vavolombelon'i Jehovah | Platform | Vokatra angon-drakitra soso-kevitra (Gb) | Fanaraha-maso kalitao |
| cDNA-PCR(Poly-A enriched) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb / santionany (miankina amin'ny karazana) | tahan'ny halavany feno> 70% Salan'isa kalitao: Q10
|
Famakafakana bioinformatics
●Fanodinana angona manta
● Famantarana an-tsoratra
● Fampifangaroana hafa
● Famaritana ny fanehoana amin'ny haavon'ny fototarazo sy ny haavon'ny isoform
● Famakafakana fomba fiteny samihafa
● Famaritana momba ny asa sy fanatsarana (DEG sy DET)
Santionany takiana sy ny fanaterana
Santionany takiana:
Nucleotides:
| Conc.(ng/μl) | Vola (μg) | fahadiovana | Tsy Nivadika |
| ≥ 100 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Voafetra na tsy misy fandotoana proteinina na ADN aseho amin'ny gel. | Ho an'ny zavamaniry: RIN≥7.0; Ho an'ny biby: RIN≥7.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; voafetra na tsy misy elevation baseline |
Tavy: Lanja (maina): ≥1 g
* Ho an'ny tavy kely kokoa noho ny 5 mg, dia manoro hevitra ny handefa santionany sela tselatra mangatsiaka (amin'ny azota azota).
Fiatoana sela: Isan'ny sela = 3×106- 1×107
* Manoro hevitra izahay handefa lysate sela mangatsiaka.Raha toa ka latsaky ny 5×10 io sela io5, tselatra mangatsiaka amin'ny azota ranon-javatra no atolotra, izay tsara kokoa ho an'ny fitrandrahana micro.
Santionan'ny ra: Volume≥1 ml
Fanaterana santionany soso-kevitra
Container: 2 ml centrifuge tube (tsy soso-kevitra)
Famaritana santionany: Vondrona + adika ohatra A1, A2, A3;B1, B2, B3...
Fandefasana: 2, ranomandry maina: Ny santionany dia mila fenoina ao anaty kitapo ary alevina ao anaty ranomandry maina.
- Tube RNAstable: Ny santionany RNA dia azo maina ao anaty fantsona fanamafisana RNA (oh RNAstable®) ary alefa amin'ny mari-pana ao amin'ny efitrano.
Fizotry ny asa fanompoana
Nucleotides:
Fanaterana santionany
Fananganana tranomboky
Sequencing
Famakafakana angona
Serivisy aorian'ny varotra
Fizotry ny asa fanompoana
Tisy:
Famolavolana andrana
Fanaterana santionany
fitrandrahana RNA
Fananganana tranomboky
Sequencing
Famakafakana angona
Serivisy aorian'ny varotra
1.Famakafakana fanehoan-kevitra samihafa -Volcano plot
Ny famakafakana fanehoan-kevitra samihafa dia azo atao amin'ny ambaratongan'ny fototarazo mba hamantarana ny fototarazo (DEGs) ary amin'ny ambaratonga isoform mba hamantarana ny fahasamihafana.
transcript voambara (DET)
2.Sarintany hafanana clustering hierarchical
3. Alternative splicing famantarana sy fanasokajiana
Karazana hetsika fanakambanana hafa dimy no azon'i Astalavista vinavinaina.
4.Famantarana hetsika poly-adenylation (APA) sy Motif amin'ny 50 bp ambony amin'ny poly-A
BMK Case
Famantarana fifandimbiasana hafa sy famenoana ambaratonga isoform amin'ny alàlan'ny filaharan'ny transcriptome feno nanopore
Navoaka:Nature Communications, 2020
Paikady filaharana:
Vondrona: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(miovaova K700E);3. Ny sela B mahazatra
Paikady filaharana: Fizarana tranomboky Minion 2D, filaharan'ny tranomboky PromethION 1D;angona vakiana fohy avy amin'ny santionany mitovy
Sequencing sehatra: Nanopore Minion;Nanopore PromethION;
Vokatra lehibe
1.Isoform-level Alternative Splicing Identification
Ny filaharan'ny famakiana lava dia manome hery ny famantarana ny mutant SF3B1K700E- novaina ny splice toerana amin'ny isoform-level.35 alternative 3′SSs sy 10 alternative 5′SSs dia hita fa misy fahasamihafana lehibe eo amin'ny SF3B1K700Esy sf3b1WT.Ny 33 amin'ireo fanovana 35 dia vao hita tamin'ny filaharana efa ela novakiana.
2.Isoform-level Alternative Splicing quantification
Fanehoana ny fitanana intron (IR) isoforms amin'ny SF3B1K700Esy sf3b1WTdia nofaritana mifototra amin'ny filaharan'ny nanopore, manambara ny fanaraha-maso manerantany momba ny isoform IR ao amin'ny SF3B1K700E.
Reference
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Ny endri-tsoratra feno amin'ny fiovan'ny SF3B1 amin'ny leukemia lymphocytic mitaiza dia manambara ny fihenan'ny intron voatazona [J].Nature Communications.
