METAGENOMIKA
Pilnīgi, slēgti baktēriju genomi no mikrobiomiem, izmantojot nanoporu sekvencēšanu
Nanoporu sekvencēšana |Metagenomika |MAGs |Baktēriju genoma cirkularizācija |Zarnu mikrobiota
Izceļ
1. Šajā pētījumā tika prezentēta jauna metode garu DNS fragmentu ekstrakcijai, kas panāca mikrogramu tīras HMW DNS ekstrakciju, kas piemērota ilgstošai sekvencēšanai no 300 mg izkārnījumu.
2. Šajā pētījumā tika ieviesta montāžas darbplūsma — virpa, kurā MAG tika montēti, veicot garus nolasījumus, un koriģēti ar īsu nolasīšanu.
3.Virpa tika novērtēta ar imitācijas maisījumu.7 no 12 baktērijām tika veiksmīgi saliktas atsevišķos kontigos un 3 tika saliktas četros vai mazāk kontigos.
4. Tālāk tika izmantota virpa izkārnījumu paraugiem, kas radīja 20 cirkulārus genomus, tostarp Prevotella copri un kandidātu Cibiobacter sp., kas bija pazīstami kā bagāti ar mobilajiem ģenētiskajiem elementiem.
Galvenais sasniegums
HWM DNS ekstrakcijas protokols
Ilgi lasīti uz sekvencēšanu balstīti zarnu metagenomiskie pētījumi jau sen ir cietuši no cietības, ekstrahējot augstas molekulmasas (HMW) DNS no izkārnījumiem.Šajā pētījumā tika ieviests uz enzīmu balstīts ekstrakcijas protokols, lai izvairītos no plašas griešanas ar lodīšu sišanu tradicionālajās metodēs.Kā parādīts nākamajā attēlā, paraugus vispirms apstrādāja ar enzīmu kokteili, tostarp lītisko enzīmu, MetaPolyzyme utt., lai noārdītu šūnu sienas.Atbrīvotā DNS tika ekstrahēta ar fenola-hloroforma sistēmu, kam sekoja proteināzes K un RNāzes A gremošana, attīrīšana uz kolonnas un SPRI izmēra izvēle.Ar šo metodi izdevās iegūt mikrogramus HMW DNS no 300 m izkārnījumiem, kas atbilst ilgi nolasītām sekvencēšanas prasībām gan kvalitātes, gan kvantitātes ziņā.
1. attēls. HWM DNS ekstrakcijas shēma
Virpas shēmas plūsma
Kā aprakstīts nākamajā attēlā, virpa satur esošo neapstrādāto bāzes izsaukšanas procesu, izmantojot Guppy.Pēc tam Flye un Canu atsevišķi ražo divus ilgi lasītus komplektus, kam seko nepareizas montāžas noteikšana un noņemšana.Abi apakšmezgli tiek apvienoti ar ātro sapludināšanu.Apvienojot, lielie mezgli megabāzes līmenī tiek pārbaudīti, vai tie nav cirkulāri.Pēc tam šo komplektu vienprātības precizēšana tiek apstrādāta ar īsiem nolasījumiem.Galīgi samontētie baktēriju genomi tiek apstrādāti galīgai nepareizas montāžas noteikšanai un noņemšanai.
2. attēls. Virpas montāžas shēmas plūsma
Virpas ar viltus baktēriju maisījumu novērtēšana
Lai novērtētu nanoporu sekvencēšanas platformas un virpas veiktspēju MAG montāžā, tika izmantots standarta ATCC 12 sugu maisījums, kas satur gan grampozitīvas, gan gramnegatīvas baktērijas.Pavisam 30, 3 Gb dati tika ģenerēti ar nanoporu platformu ar N50 5, 9 kb.Virpa ievērojami uzlaboja montāžu N50 līdz 1,6 līdz 4 reizēm salīdzinājumā ar citiem ilgi lasītiem montāžas instrumentiem un 2 līdz 9 reizēm salīdzinājumā ar hibrīdajiem montāžas instrumentiem.No 12 baktēriju genomiem septiņi tika salikti atsevišķos kontigos (3. attēls. Cirkos ar melnu punktu).Vēl trīs tika salikti četros vai mazāk kontigos, kuros visnepilnīgākajā komplektācijā bija 83% genoma vienā kontigā.
3. attēls. Genoma komplekti noteiktā 12 sugu baktēriju maisījumā
Virpas pielietošana izkārnījumu paraugos
Šī metode tika tālāk izmantota cilvēka izkārnījumu paraugiem, lai salīdzinātu organisma identifikāciju un montāžas atbilstību esošajām metodēm, lasīšanas mākonī un uz īsu nolasīšanu balstītu analīzi.No trim iesaistītajiem paraugiem jaunā uz enzīmu balstītā ekstrakcija deva vismaz 1 μg uz 300 mg ievades masas.Šo HMW DNS nanoporu sekvencēšana radīja ilgus nolasījumus ar N50 attiecīgi 4,7 kb, 3,0 kb un 3,0 kb.Proti, pašreizējā metode parādīja lielu potenciālu mikrobu noteikšanā, salīdzinot ar esošajām metodēm.Šeit tika parādīta salīdzinoši augstāka sugu līmeņa alfa daudzveidība, salīdzinot ar īsu lasīšanas un lasīšanas mākoni.Turklāt ar šo metodi tika atgūtas visas ģintis no īstermiņa analīzes, pat parasti pret līzi rezistenti grampozitīvi organismi.
4. attēls. Alfa daudzveidība un taksonomiskie komponenti, kas noteikti ar Nanopore, short-read un read-cloud metodes
Neraugoties uz trīs līdz sešas reizes mazāku neapstrādātu datu ievadi, virpa nodrošināja daudz ilgāku N50 komplektu nekā īslasīšanas un lasīšanas mākoņa montāža.Melnrakstu genomi tika iegūti, izmantojot kontig binning, kurā melnraksti tika klasificēti kā "augstas kvalitātes" vai "daļēji", pamatojoties uz pilnīgumu, piesārņojumu, vienas kopijas kodola gēniem utt. Ilgi lasīta montāža uzrādīja daudz lielāku blakusesību ar zemākām izmaksām. īslaicīgai lasīšanai un lasīšanai-mākonim.
5. attēls. Katras metodes blakusesība katram organismam
Turklāt pašreizējā montāžas pieeja spēj radīt slēgtus, apļveida genomus.Izkārnījumu paraugos tika apkopoti astoņi augstas kvalitātes viena kontig genomi, un piecos no tiem tika panākta perēzes cirkularizācija.Ilgi lasīta pieeja arī parādīja iespaidīgu spēju atrisināt atkārtotus elementus genomos.ApļveidaP. coprigenoms tika ģenerēts ar šo pieeju, kas, kā zināms, satur augstu secības atkārtošanās pakāpi.Labākā šī genoma montāža, izmantojot īsas lasīšanas un lasīšanas mākoni, nekad nepārsniedza 130 kb N50, pat ar pārklājuma dziļumu 4800 X.Šie elementi ar lielu kopiju skaitu tika pilnībā atrisināti, izmantojot ilgstošas lasīšanas pieeju, kas bieži tika konstatēta īslaicīgas lasīšanas vai lasīšanas mākoņa mezglu lūzuma punktos.Šajā pētījumā tika ziņots par citu slēgtu genomu, kas, domājams, ir nesen aprakstītā loceklisCibiobaktērijaklade.Šajā slēgtajā komplektā tika identificēti pieci iespējamie fāgi, kuru lielums bija no 8, 5 līdz 65, 9 kb.
6. attēls. P.copri un Cibiobacter sp. slēgto genomu cirkosa diagramma.
Atsauce
Moss, EL, Maghini, DG un Bhatt, AS (2020).Pilnīgi, slēgti baktēriju genomi no mikrobiomiem, izmantojot nanoporu sekvencēšanu.Dabas biotehnoloģija,38(6), 701-707.
Tehnika un svarīgākie Mērķis ir dalīties ar jaunākajiem veiksmīgākajiem dažādu augstas caurlaidības sekvencēšanas tehnoloģiju pielietojumiem dažādās pētniecības jomās, kā arī ar izcilām idejām eksperimentālajā projektēšanā un datu ieguvē.
Publicēšanas laiks: 07.01.2022