CILVĒKA GENOMIKA
dabas ģenētika
Ilgi lasīta sekvencēšana identificē GGC atkārtojumus NOTCH2NLC, kas saistīti ar neironu intranukleāro iekļaušanas slimību
ONT atkārtota secība |Illumina |Visa eksoma sekvencēšana |CRISPR-Cas9 ONT mērķtiecīga sekvencēšana |RNS-seq |ONT 5mC metilēšanas zvans
Izceļ
1. Veicot saišu analīzi lielai NIID saimei, tika identificēti divi saistīti reģioni.
2. Uz ONT balstīta ilgstošas nolasīšanas sekvencēšana un Cas-9 mediēta bagātināšana ONT sekvencēšana atklāja potenciālu NIID, GGC atkārtošanās paplašināšanās ģenētisko cēloni NOTCH2NLC 5′ UTR.Šis pētījums pirmo reizi ziņoja par atkārtotu cilvēka specifisko gēnu paplašināšanos, kas attīstījās segmentālo dublēšanās rezultātā.
3.RNS sekvencēšana atklāja patoloģiskus antisensu transkriptus GGC atkārtojuma izplešanās reģionos NOTCH2NLC sākumā vai iekšpusē.
Fons
Neuronal intranukleārās iekļaušanas slimība (NIID) ir progresējoša un letāla neirodeģeneratīva slimība, ko raksturo eozinofīlo hialīna intranukleāro ieslēgumu klātbūtne centrālajā un perifērajā nervu sistēmā.Tās ļoti mainīgās klīniskās izpausmes rada lielas diagnozes grūtības līdz ādas biopsijas ieviešanai.Tomēr uz histopatoloģiju balstītas metodes joprojām cieš no nepareizas diagnozes, kas prasa ģenētisku izpratni par NIID.
Sasniegumi
Saiknes analīze
SVisa genoma sekvencēšana (WGS) un visa eksoma sekvencēšana (WES) tika veikta lielai NIID saimei (13 skartie un 7 neskartie locekļi).Saiknes analīze SNP, kas iegūta no šiem datiem, atklāja tikai divus saistītus reģionus: 3,5 Mb reģionu pie 1p36,31-p36,22 (maksimālais LOD = 2,32) un 58,1 Mb reģionu pie 1p22,1-q21,3 (maksimālais LOD: 4,21). ).Tomēr šajos saistītajos reģionos netika identificēti patogēni SNP vai CNV.
GGC atkārto NOTCH2NLC paplašinājumus
NUz anoporu balstīta sekvencēšana tika apstrādāta 13 skartajiem un 4 neskartajiem locekļiem no 8 ģimenēm (citu skarto locekli sekvencēja Pacbio ilgstošas lasīšanas sekvencēšanas platforma.).Ilgi lasīti dati atklāja ar slimību saistītus GGC atkārtojumus NOTCH2NLC gēnu kartēšanas 58,1 Mb saistītajā reģionā 5′ UTR (1. attēls).Šie atkārtotie paplašinājumi tika identificēti arī visos 40 sporādiskos NIID gadījumos, kas pārbaudīti ar RP-PCR.
CTika izmantota as-9 mediēta mērķa sekvencēšana nanoporu platformā, lai panāktu lielāku lasīšanas pārklājumu NOTCH2NLC atkārtojumā (100 x -1795 X).Šīs vienprātības secības labi saskanēja ar iepriekšējiem atklājumiem par GGC atkārtotu paplašināšanu.Turklāt {(GGA)n (GGC)n}n atkārtojumi tika identificēti kā potenciāls vājuma dominējošā fenotipa ģenētiskais marķieris (2. attēls).
1. attēls. Ar slimību saistīta atkārtota izplešanās, kas identificēta NOTCH2NLC izoformu 1. eksonā.
2. attēls. NPTCH2NLC atkārtojuma konsensa secības NIID pacientiem ar (*) vai bez vājuma dominējošā fenotipa
NOTCH2NL gēni ir cilvēkam specifiski gēni, kuriem, domājams, ir būtiska loma cilvēka smadzeņu evolūcijā un neiroloģiskās slimībās.Tomēr trīs ar NOTCH2 saistīti gēni (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB un NOTCH2NLC) ar> 99, 1% sekvences identitāti netika atrisināti līdz jaunākajai cilvēka genoma montāžai.Bezsintēzes un ilgi nolasāma sekvencēšana nanoporu platformā ir parādījusi ievērojamas priekšrocības, atrisinot apgabalus ar augstu līdzību un (GGC) n atkārtojumiem ar 100% GC bagātu.
GGC atkārto NOTCH2NLC paplašinājumus
Transcriptome sekvencēšana tika apstrādāta 2 ietekmētajiem un 2 neietekmētajiem dalībniekiem.Normalizētais nolasīšanas dziļums tika aprēķināts sensoru un antisensu pavedieniem augšpus NOTCH2NL paralogu pirmajiem eksoniem.Patoloģiski anti-sense transkripti tika konstatēti tikai skartajos gadījumos, kas atrodas atkārtotas izplešanās reģiona sākumā vai iekšpusē (purpursarkanās virsotnes F1-14 un F1-16 3. attēlā).Turklāt tika identificēti 54 DEG, un visi tika bagātināti ar GO un MPO terminiem, kas saistīti ar neironu funkcijām.
3. attēls. Normalizēts nolasīšanas dziļums augšpus NOTCH2NLC pirmā eksona neskartajos (augšējā) un ietekmētajos (zemāk) gadījumos.
Tehnoloģija
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nanoporu sekvencēšana atšķiras no citām sekvencēšanas platformām ar to, ka nukleotīdus nolasa tieši bez DNS sintēzes procesa.Kad viena virkne DNS iziet cauri nanoizmēra proteīna porām (nanoporām), dažādi nukleotīdi ģenerē dažādas jonu strāvas, kuras var uztvert un pārnest bāzu secībā.Pati ONT sekvencēšanas platforma neuzrāda acīmredzamus tehniskos ierobežojumus DNS nolasīšanas garumam.Tāpēc augstas kvalitātes genoma montāžai ir pieejami īpaši garie nolasījumi (ULR).Turklāt šie ārkārtīgi garie nolasījumi, kas ir pietiekami ilgi, lai šķērsotu sarežģītas secības iezīmes vai strukturālas variācijas, palīdz pārvarēt īsas nolasīšanas secības ierobežojumus.
Nanoporu sekvencēšana
Struktūras variācijas (SV) identifikācija
Sbezsintēzes sekvencēšana lielā mērā saglabāja DNS metilēšanas informāciju veidnē.Metilēti A, T, C un G ģenerē atšķirīgas jonu strāvas no nemetilētām, kuras platforma var nolasīt tieši.Nanoporu sekvencēšana nodrošina visa genoma profilēšanu gan 5mC, gan 6mA ar viena nukleotīda izšķirtspēju.
Atsauce
Jun Sone u.c.al.Ilgi lasīta sekvencēšana identificē GGC atkārtojumus NOTCH2NLC, kas saistīti ar neironu intranukleāro iekļaušanas slimību.Dabas ģenētika (2019)
Tehnika un svarīgākie Mērķis ir dalīties ar jaunākajiem veiksmīgākajiem dažādu augstas caurlaidības sekvencēšanas tehnoloģiju pielietojumiem dažādās pētniecības jomās, kā arī ar izcilām idejām eksperimentālajā projektēšanā un datu ieguvē.
Izlikšanas laiks: Jan-06-2022