VISA GENOMA IZMEKLĒŠANA
SARS-CoV-2 genomikas uzraudzība atklāj Nsp1 dzēšanas variantu, kas modulē I tipa interferona reakciju
Nanopore |Illumina |Visa genoma atkārtota sekvencēšana |metagenomika |RNA-Seq |Sanger
Šajā pētījumā Biomarker Technologies sniedza tehnisko atbalstu paraugu sekvencēšanai.
Izceļ
1. SARS-CoV-2 genoma sekvencēšana un filoģenētiskā analīze identificē 35 atkārtotas mutācijas, tostarp 31 SNP un 4 Indels.
2. Saistība ar 117 klīniskiem fenotipiem atklāj potenciāli
svarīgas mutācijas.
∆500-532 Nsp1 kodošajā reģionā korelē ar zemāku vīrusu
3.slodze un seruma IFN-β.
4. Vīrusu izolāti ar ∆500-532 mutāciju inducē zemāku IFN-I
atbilde inficētajās šūnās.
Eksperimentālais dizains
Sasniegumi
1. Covid-19 epidemioloģiskā un genoma uzraudzība
Klīniskie dati tika vākti Sičuaņas provincē, Ķīnā visā uzliesmojuma periodā no 2020. gada 22. janvāra līdz 2020. gada 20. februārim. Sičuaņā ar qPCR testiem kopumā tika apstiprināti 538 Covid-19 gadījumi, no kuriem 28,8% bija no provinces. kapitāls.Apstiprināto gadījumu skaits Sičuaņā pieauga eksponenciāli, sasniedzot maksimumu 30. janvārī.Dati arī apstiprināja, ka sociālā distancēšanās var būt galvenais faktors vīrusa izplatības novēršanā.
1. attēls. Covid-19 epidemioloģiskais pētījums Sičuaņas provincē, Ķīnā
2. SARS-CoV-2 genoma uzbūve un variantu identificēšana
Izmantojot multipleksu PCR amplifikāciju, kam sekoja nanoporu sekvencēšana, kopumā tika izveidoti 310 gandrīz vai daļēji pilnīgi genomi no 248 pacientiem ar apm.80% genomu aptver 10 nolasījumi (vidējais dziļums: 0,39 M nolasījumu vienā paraugā).
2. attēls. Katra varianta biežums Sičuaņas kohortā
Kopumā no SARS-CoV-2 genomiem tika identificēti 104 SNP un 18 Indels, kuros 31 SNP un 4 Indels tika identificēti kā atkārtoti ģenētiski varianti.Salīdzinot tos ar 169 paraugiem no Uhaņas un ar 81 391 augstas kvalitātes publiskā genoma sekvences GISAID, 29 no 35 variantiem, kas atrasti citos kontinentos.Jo īpaši tika konstatēts, ka četri varianti, tostarp ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 un T13243C, ir sastopami tikai Sičuaņā un Uhaņā, un tie nebija GISAID datos, norādot, ka šie varianti, ļoti iespējams, tiks aizsargāti no Uhaņas, kas atbilst pacientu ceļojumu ieraksti.
Evolūcijas analīze ar maksimālās iespējamības (ML) metodi un Beijesa molekulārā pulksteņa pieejām tika apstrādāta ar 88 jauniem vīrusiem no Sičuaņas un 250 atlasītiem genomiem no citiem reģioniem.Genomi ar ∆500-532 (delecijas Nsp1 kodēšanas reģionā) tika atrasti reti izplatīti filoģenētiskajā kokā.Nsp1 variantu haplotipa analīze identificēja 5 no tiem no vairākām pilsētām.Šie rezultāti liecināja, ka ∆500-532 radās vairākās pilsētās un var tikt importētas vairākas reizes no Uhaņas.
2. attēls. Atkārtoti ģenētiskie varianti un filoģenētiskā analīze SARS-CoV-2 genomos
3. Atkārtotu ģenētisko variantu saistība ar klīniskām sekām
117 klīniskie fenotipi bija saistīti ar COVID-19 smaguma pakāpi, kur 19 ar smaguma pakāpi saistīti fenotipi tika klasificēti smagās un nesmagās pazīmēs.Saistība starp šīm pazīmēm un 35 atkārtotiem ģenētiskajiem variantiem tika vizualizēta divu klasteru siltuma kartē.GSEA līdzīga ranžēta bagātināšanas analīze parādīja, ka ∆500-532 negatīvi korelē ar ESR, seruma IFN-β un CD3+CD8+ T šūnu skaitu asinīs.Turklāt qPCR testi parādīja, ka pacientiem, kas inficēti ar vīrusu, kas satur ∆500-532, bija visaugstākā Ct vērtība, ti, zemākā vīrusu slodze.
3. attēls. 35 atkārtotu ģenētisko variantu asociācijas ar klīniskajiem fenotipiem
4. Ar vīrusu mutācijām saistīto klīnisko fenotipu validācija
Lai izprastu ∆500-532 ietekmi uz Nsp1 funkcijām, HEK239T šūnas tika transficētas ar plazmīdām, kas ekspresē pilna garuma, WT Nsp1 un mutācijas formas ar delēcijām.Katras apstrādātās HEK239T šūnas transkripta profili tika apstrādāti PCA analīzei, parādot, ka dzēšanas mutanti grupējās salīdzinoši tuvāk un ievērojami atšķiras no WT Nsp1.Gēni, kas mutantos tika būtiski regulēti, galvenokārt tika bagātināti ar “peptīdu biosintēzes/vielmaiņas procesu”, “ribonukleoproteīnu kompleksa bioģenēzi”, “olbaltumvielu mērķēšanu uz membrānu/ER” utt. Turklāt divas dzēšanas parādīja atšķirīgu izplatīšanās modeli no WT.
4. attēls. Transkriptu analīze HEK239T šūnām, kas transficētas ar WT Nsp1 un ar delecijām
Delēciju ietekme uz IFN-1 reakciju tika pārbaudīta arī pārmērīgas ekspresijas pētījumā.Tika pierādīts, ka visas pārbaudītās dzēšanas samazina IFN-1 reakciju transfektētajās HEK239T un A549 šūnās gan transkripta, gan proteīna līmenī.Interesanti, ka delēcijās ievērojami samazinātie gēni tika bagātināti ar “aizsardzības reakciju pret vīrusu”, “vīrusa genoma replikāciju”, “RNS polimerāzes II transkripcijas regulēšanu” un “reakciju uz I tipa interferonu”.
5. attēls. Interferona signalizācijas ceļu pazemināšanās ∆500-532 mutantā
Šajā pētījumā šo svītrojumu ietekmi uz vīrusu vēl vairāk apstiprināja vīrusu infekcijas pētījumi.Vīrusi ar noteiktiem mutantiem tika izolēti no klīniskajiem paraugiem un inficēti ar Calu-3 šūnām.Detalizētus vīrusu infekcijas pētījuma rezultātus var izlasīt rakstā.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Atsauce
Lin J, Tang C, Wei H u.c.SARS-CoV-2 genoma uzraudzība atklāj Nsp1 dzēšanas variantu, kas modulē I tipa interferona reakciju [J].Šūnu saimnieks un mikrobi, 2021.
Jaunumi un svarīgākie notikumi mērķis ir dalīties ar jaunākajiem veiksmīgajiem gadījumiem ar Biomarker Technologies, tverot jaunus zinātnes sasniegumus, kā arī ievērojamas metodes, kas izmantotas pētījuma laikā.
Izlikšanas laiks: Jan-06-2022