METAGENOMIKA
Išsamūs, uždari bakterijų genomai iš mikrobiomų, naudojant nanoporų seką
Nanoporų sekos nustatymas |Metagenomika |MAG |Bakterijų genomo cirkuliacija |Žarnyno mikrobiota
Pabrėžia
1. Šiame tyrime buvo pristatytas naujas ilgų DNR fragmentų išgavimo metodas, kurio metu iš 300 mg išmatų buvo išgauti mikrogramai grynos HMW DNR, tinkamos ilgai nuskaityti sekos nustatymui.
2. Šiame tyrime buvo pristatyta surinkimo darbo eiga „Lathe“, kai MAG buvo surinkti ilgai nuskaitant ir pataisyti trumpai.
3.Tekinimo staklės buvo įvertintos imitaciniu mišiniu.7 iš 12 bakterijų buvo sėkmingai surinktos į atskirus kontigus, o 3 - į keturis ar mažiau kontigų.
4. Tekinimo staklės buvo toliau naudojamos išmatų mėginiams, kurie sukūrė 20 cirkuliarinių genomų, įskaitant Prevotella copri ir kandidatą Cibiobacter sp., kurie buvo žinomi dėl to, kad juose gausu mobiliųjų genetinių elementų.
Pagrindinis pasiekimas
HWM DNR ekstrahavimo protokolas
Ilgai skaitomi sekos nustatymu pagrįsti žarnyno metagenominiai tyrimai ilgą laiką kenčia nuo kietumo išskiriant didelės molekulinės masės (HMW) DNR iš išmatų.Šiame tyrime buvo įvestas fermentų pagrindu sukurtas ekstrahavimo protokolas, siekiant išvengti didelio kirpimo daužant karoliukus tradiciniais metodais.Kaip parodyta toliau pateiktame paveikslėlyje, mėginiai pirmiausia buvo apdoroti fermentų kokteiliu, įskaitant lizinį fermentą, MetaPolyzyme ir kt., Kad suardytų ląstelių sieneles.Išsiskyrusi DNR buvo ekstrahuota fenolio-chloroformo sistema, po to buvo atlikta proteinazės K ir RNazės A virškinimas, valymas kolonėlėmis ir SPRI dydžio parinkimas.Šiuo metodu pavyko gauti mikrogramus HMW DNR iš 300 m išmatų, kuri atitinka ilgai skaitytus sekos nustatymo reikalavimus tiek kokybės, tiek kiekybės požiūriu.
1 pav. HWM DNR išskyrimo schema
Tekinimo staklės schema
Kaip aprašyta toliau pateiktame paveikslėlyje, tekinimo sistemoje yra esamas neapdoroto bazinio skambinimo procesas naudojant Guppy.Tada „Flye“ ir „Canu“ atskirai gamina du ilgai skaitytus mazgus, o po to aptinka ir pašalina netinkamą surinkimą.Du mazgai sujungiami naudojant greitąjį sujungimą.Sujungus, dideli agregatai megabazės lygiu tikrinami, ar nėra cirkuliacijos.Vėliau konsensuso patikslinimas dėl šių mazgų apdorojamas trumpais skaitymais.Galutiniai surinkti bakterijų genomai apdorojami, kad būtų galima nustatyti ir pašalinti galutinį klaidingą surinkimą.
2 pav. Tekinimo staklių surinkimo schema
Tekinimo staklių su netikrų bakterijų mišiniu įvertinimas
Standartinis ATCC 12 rūšių mišinys, kuriame yra ir gramteigiamų, ir gramneigiamų bakterijų, buvo naudojamas nanoporų sekos nustatymo platformos ir tekinimo staklės veikimui įvertinti MAG surinkime.Iš viso 30, 3 Gb duomenų sugeneravo nanoporų platforma su 5, 9 kb N50.Tekinimo staklės žymiai pagerino N50 surinkimą – nuo 1,6 iki 4 kartų, palyginti su kitais ilgai skaitytais surinkimo įrankiais, ir 2–9 kartus, palyginti su hibridiniais surinkimo įrankiais.Iš 12 bakterijų genomų septyni buvo surinkti į atskirus kontigus (3 pav. Cirkos su juodu tašku).Dar trys buvo surinkti į keturis ar mažiau kontigų, kuriuose labiausiai neišsamioje komplektacijoje buvo 83% genomo viename kontige.
3 pav. Genomo rinkiniai apibrėžtame 12 rūšių bakterijų mišinyje
Tekinimo staklės taikymas išmatų mėginiams
Šis metodas buvo toliau taikomas žmogaus išmatų mėginiams, siekiant palyginti organizmo identifikavimą ir surinkimo gretumą su esamais metodais, skaitymo debesies ir trumpojo skaitymo analize.Iš trijų dalyvaujančių mėginių naujasis fermentų ekstraktas davė mažiausiai 1 μg 300 mg įvesties masės.Šių HMW DNR nanoporinė seka sukūrė ilgą skaitymą su N50 atitinkamai 4,7 kb, 3,0 kb ir 3,0 kb.Pažymėtina, kad dabartinis metodas parodė didelį mikrobų aptikimo potencialą, palyginti su esamais metodais.Čia buvo parodyta santykinai didesnė rūšių alfa įvairovė, palyginti su trumpo skaitymo ir skaitymo debesimis.Be to, šiuo metodu buvo išgauta visos gentys iš trumpo skaitymo analizės, net paprastai lizei atsparių gramteigiamų organizmų.
4 pav. Alfa įvairovė ir taksonominiai komponentai, nustatyti Nanopore, trumpojo skaitymo ir skaitymo debesies metodais
Tekinimo staklės davė daug ilgesnį visą surinkimą N50 nei trumpo nuskaitymo ir skaitymo debesies surinkimas, nepaisant trijų iki šešių kartų mažesnio neapdorotų duomenų įvesties.Genomų juodraštis buvo sukurtas kontiginio sujungimo būdu, kai juodraščiai buvo klasifikuojami į „aukštos kokybės“ arba „dalinius“, atsižvelgiant į išsamumą, užterštumą, vienos kopijos branduolio genus ir kt. Ilgai skaitytas surinkimas parodė daug didesnį gretimumą mažesnėmis sąnaudomis, palyginti su trumpai skaityti ir skaityti debesyje.
5 pav. Kiekvieno metodo susijungimo sujungimas pagal organizmą
Be to, dabartinis surinkimo metodas gali duoti uždarus, apskritus genomus.Išmatų mėginiuose buvo surinkti aštuoni aukštos kokybės vieno kontiginio genomai ir penki iš jų pasiekė cirkuliaciją.Ilgai skaitytas metodas taip pat parodė įspūdingą gebėjimą išspręsti pasikartojančius genomų elementus.CircularP. coprigenomas buvo sukurtas naudojant šį metodą, kuris, kaip žinoma, turi didelį sekos pasikartojimo laipsnį.Geriausias šio genomo surinkimas naudojant trumpo skaitymo ir skaitymo debesį niekada neviršijo 130 kb N50, net jei aprėpties gylis buvo 4800X.Šie didelio kopijų skaičiaus elementai buvo visiškai išspręsti taikant ilgo skaitymo metodą, kuris dažnai aptinkamas trumpo skaitymo arba skaitymo-debesų rinkinių lūžio taškuose.Šiame tyrime buvo pranešta apie dar vieną uždarą genomą, kuris, kaip manoma, yra neseniai aprašyto genomo narysCibiobakterijoskladas.Šiame uždarame rinkinyje buvo nustatyti penki galimi fagai, kurių dydis svyruoja nuo 8, 5 iki 65, 9 kb.
6 pav. P.copri ir Cibiobacter sp. uždarų genomų cirko diagrama.
Nuoroda
Moss, EL, Maghini, DG ir Bhatt, AS (2020).Išsamūs, uždari bakterijų genomai iš mikrobiomų, naudojant nanoporų seką.Gamtos biotechnologija,38(6), 701-707.
Technika ir svarbiausi dalykai siekia pasidalyti naujausiomis sėkmingomis įvairių didelio našumo sekos nustatymo technologijų taikymomis įvairiose tyrimų srityse, taip pat puikiomis eksperimentinio dizaino ir duomenų gavybos idėjomis.
Paskelbimo laikas: 2022-07-07