ŽMOGAUS GENOMIKA
gamtos genetika
Ilgai skaityta seka identifikuoja GGC pasikartojimo išplėtimus NOTCH2NLC, susijusius su neuronų intranuklearinės inkliuzijos liga
ONT pakartotinė seka |Iliumina |Viso egzomo sekos nustatymas |CRISPR-Cas9 ONT tikslinė sekos nustatymas |RNR-seq |ONT 5mC metilinimo skambutis
Pabrėžia
1. Atlikus didelės NIID šeimos sąsajos analizę, buvo nustatyti du susieti regionai.
2.ONT pagrįstas ilgo skaitymo sekos nustatymas ir Cas-9 tarpininkaujantis sodrinimas ONT sekos nustatymas atrado galimą genetinę NIID, GGC pakartotinių išsiplėtimų priežastį NOTCH2NLC 5′ UTR.Šis tyrimas pirmą kartą pranešė apie pasikartojančius žmogui būdingų genų išsiplėtimus, kurie išsivystė per segmentinius dubliavimus.
3.RNR sekos nustatymas atskleidė nenormalius antisensinius transkriptus NOTCH2NLC GGC kartojimo išplėtimo srityse.
Fonas
Neuronal intranuclear inclusion liga (NIID) yra progresuojanti ir mirtina neurodegeneracinė liga, kuriai būdingas eozinofilinių hialininių intranuklearinių inkliuzų buvimas centrinėje ir periferinėje nervų sistemose.Jos labai įvairios klinikinės apraiškos kelia didelių sunkumų diagnozuojant iki odos biopsijos įvedimo.Tačiau histopatologija pagrįsti metodai vis dar kenčia nuo klaidingos diagnozės, todėl reikia genetiškai suprasti NIID.
Pasiekimai
Ryšio analizė
SHort skaitymo sekos nustatymu pagrįsta viso genomo sekos (WGS) ir viso egzomo sekos nustatymas (WES) buvo atliktas didelėje NIID šeimoje (13 paveiktų ir 7 nepaveiktų narių).Iš šių duomenų išskirtų SNP sąsajų analizė atskleidė tik du susietus regionus: 3,5 Mb sritį ties 1p36,31-p36,22 (maksimalus LOD = 2,32) ir 58,1 Mb sritį ties 1p22,1-q21,3 (maksimalus LOD: 4,21). ).Tačiau šiuose susietuose regionuose nebuvo nustatyta jokių patogeninių SNP ar CNV.
GGC kartoja išplėtimus NOTCH2NLC
NAnopore pagrįsta seka buvo apdorota 13 paveiktų ir 4 nepaveiktų narių iš 8 šeimų (kitas paveiktas narys buvo sekvenuotas naudojant Pacbio ilgo skaitymo sekos platformą.).Ilgai skaityti duomenys atskleidė su liga susijusius GGC pakartotinius išsiplėtimus NOTCH2NLC geno 5′ UTR, susieto su 58,1 Mb susietu regionu (1 pav.).Šie pakartotiniai išsiplėtimai taip pat buvo nustatyti visais 40 atsitiktinių NIID atvejų, patikrintų RP-PGR.
CAs-9 tarpininkaujamas taikinių sekos nustatymas nanoporų platformoje buvo naudojamas norint pasiekti didesnį skaitymo aprėptį NOTCH2NLC pakartojime (100 X-1 795 X).Šios konsensuso sekos gerai sutapo su ankstesnėmis išvadomis dėl GGC pakartotinio išplėtimo.Be to, {(GGA) n (GGC) n} n pakartojimai buvo nustatyti kaip galimas silpnumo dominuojančio fenotipo genetinis žymeklis (2 pav.).
1 pav. Su liga susijęs pasikartojantis išsiplėtimas, nustatytas NOTCH2NLC izoformų 1 egzone.
2 pav. NPTCH2NLC pasikartojimo konsensuso sekos NIID pacientams, turintiems (*) arba be silpnumo dominuojančio fenotipo
NOTCH2NL genai yra žmogui būdingi genai, kurie, kaip manoma, atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį žmogaus smegenų evoliucijoje ir neurologinėse ligose.Tačiau trys su NOTCH2 susiję genai (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB ir NOTCH2NLC), kurių sekos tapatumas > 99,1%, nebuvo išspręsti iki paskutinio žmogaus genomo surinkimo.Be sintezės ir ilgai skaitoma seka nanoporų platformoje parodė didelius pranašumus sprendžiant didelio panašumo regionus ir (GGC) n pasikartojimus, kuriuose yra 100% GC.
GGC kartoja išplėtimus NOTCH2NLC
Transcriptome seka buvo apdorota 2 paveiktiems ir 2 nepaveiktiems nariams.Normalizuotas skaitymo gylis buvo apskaičiuotas sensorinėse ir antisensinėse gijose prieš pirmuosius NOTCH2NL paralogų egzonus.Nenormalūs antisensiniai nuorašai buvo nustatyti tik paveiktais atvejais, kurie yra kartotinės išsiplėtimo srities pradžioje arba viduje (violetinės smailės F1-14 ir F1-16 3 pav.).Be to, buvo nustatyti 54 DEG ir visi buvo praturtinti GO ir MPO terminais, susijusiais su neuronų funkcijomis.
3 pav. Normalizuotas skaitymo gylis prieš pirmąjį NOTCH2NLC egzoną nepaveiktais (aukščiau) ir paveiktais (žemiau) atvejais.
Technologijos
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nanoporinė sekos nustatymas iš kitų sekvenavimo platformų išsiskiria tuo, kad nukleotidai nuskaitomi tiesiogiai be DNR sintezės proceso.Kai vienos grandinės DNR praeina per nano dydžio baltymo poras (nanoporas), skirtingi nukleotidai generuoja skirtingas jonų sroves, kurias galima užfiksuoti ir perkelti į bazių seką.Pati ONT sekos nustatymo platforma nerodo akivaizdžių techninių DNR skaitymo ilgio ribos.Todėl aukštos kokybės genomo surinkimui galimi itin ilgi skaitymai (ULR).Be to, šie itin ilgi skaitymai, kurie yra pakankamai ilgi, kad galėtų įveikti sudėtingas sekos ypatybes ar struktūrinius pokyčius, padeda įveikti trumpo skaitymo sekos apribojimus.
Nanoporų seka
Struktūros kitimo (SV) identifikavimas
Sbe sintezės sekos iš esmės išsaugojo DNR metilinimo informaciją šablone.Metilintas A, T, C ir G generuoja skirtingas jonines sroves nuo nemetilintų, kurias platforma gali nuskaityti tiesiogiai.Nanoporų sekos nustatymas suteikia galimybę viso genomo profiliuoti tiek 5 mC, tiek 6 mA esant vieno nukleotido skyrai.
Nuoroda
Jun Sone ir kt.al.Ilgai skaitoma seka identifikuoja GGC pasikartojimo išplėtimus NOTCH2NLC, susijusius su neuronų intranuklearinės inkliuzijos liga.Gamtos genetika (2019 m.)
Technika ir svarbiausi dalykai siekia pasidalyti naujausiomis sėkmingomis įvairių didelio našumo sekos nustatymo technologijų taikymomis įvairiose tyrimų srityse, taip pat puikiomis eksperimentinio dizaino ir duomenų gavybos idėjomis.
Paskelbimo laikas: 2022-06-06