TRANSKRIPTOMIKA
gamta
KOMUNIKACIJOS
Lėtinės limfocitinės leukemijos SF3B1 mutacijos viso ilgio nuorašo apibūdinimas atskleidžia sumažėjusį sulaikytų intronų reguliavimą
Viso ilgio nuorašai|Nanoporų seka|Alternatyvi izoformų analizė
Fonas
SPlačiai pranešta, kad splaisingo faktoriaus SF3B1 omatinės mutacijos yra susijusios su įvairiomis vėžio formomis, įskaitant lėtinę limfocitinę leukemiją (LLL), uvealinę melanomą, krūties vėžį ir kt. Be to, trumpi transkriptominiai tyrimai atskleidė SF3B1 mutacijų sukeltus nenormalius splaisingo modelius.Tačiau šių alternatyvių sujungimo modelių tyrimai jau seniai apsiribojo įvykių lygiu ir žinių apie izoformų lygiu trūkumą dėl trumpai skaitomų surinktų nuorašų apribojimų.Čia buvo pristatyta nanoporų sekos nustatymo platforma, skirta sukurti viso ilgio transkriptus, kurie suteikė galimybę tirti AS izoformas.
Eksperimentinis dizainas
Eksperimentai
Grupavimas:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E mutacija);3. Normalios B ląstelės
Sekos nustatymo strategija:MinION 2D bibliotekos sekos nustatymas, PromethION 1D bibliotekos sekos nustatymas;trumpai nuskaityti duomenys iš tų pačių pavyzdžių
Sekos nustatymo platforma:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatinė analizė
Rezultatai
Aiš 6 CLL mėginių ir 3 B ląstelių buvo nuskaityti 257 milijonai.Vidutiniškai 30,5% šių skaitymų buvo identifikuoti kaip viso ilgio nuorašai.
Fbuvo sukurta plataus ilgio alternatyvi RNR izoformų analizė (FLAIR), siekiant sukurti didelio patikimumo izoformų rinkinį.FLAIR galima apibendrinti taip:
Nanopore skaitymo lygiavimas: nustatyti bendrą nuorašo struktūrą, pagrįstą etaloniniu genomu;
Spločio sankryžos taisymas: ištaisykite sekos klaidas (raudona) su sandūros vieta iš anotuotų intronų, intronų iš trumpai nuskaitytų duomenų arba abiejų;
Collapse: apibendrinkite reprezentatyvias izoformas, pagrįstas sandūrų jungties grandinėmis (pirmojo praėjimo rinkinys).Pasirinkite didelio patikimumo isofrom pagal palaikomųjų skaitymų skaičių (slenkstis: 3).
1 pav. FLAIR analizė, skirta nustatyti pilno ilgio izoformas, susijusias su SF3B1 mutacija sergant LLL
FLAIR nustatė 326 699 didelio patikimumo susietas izoformas, iš kurių 90 % yra naujos izoformos.Nustatyta, kad dauguma šių nekontuotų izoformų yra nauji žinomų sujungimo jungčių deriniai (142 971), o kitose naujose izoformose buvo arba išlikęs intronas (21 700), arba naujas egzonas (3594).
Lnuolat skaitomos sekos leidžia identifikuoti mutantų SF3B1-K700E pakeistas sujungimo vietas izoformos lygiu.Nustatyta, kad 35 alternatyvūs 3'SS ir 10 alternatyvių 5'SS yra labai skirtingai sujungti tarp SF3B1-K700E ir SF3B1-WT.33 iš 35 pakeitimų buvo naujai aptikti ilgai skaitytomis sekomis.Nanopore duomenimis, atstumo pasiskirstymas tarp SF3B1-K700E pakeistų 3'SS iki kanoninių vietų smailių yra apie -20 bp, o tai labai skiriasi nuo kontrolinio pasiskirstymo, panašiai kaip buvo pranešta CLL trumpo skaitymo sekose.Buvo analizuojamos ERGIC3 geno izoformos, kur nauja izoforma, turinti proksimalinę susijungimo vietą, buvo rasta gausesnė SF3B1-K700E .Tiek proksimalinis, tiek distalinis 3'SS buvo susiję su skirtingais AS modeliais, generuojančiais kelias izoformas.
2 pav. Alternatyvūs 3′ sujungimo modeliai, identifikuoti naudojant nanoporų sekos duomenis
IR įvykių naudojimo analizė ilgą laiką buvo ribota atliekant trumpo skaitymo analizę dėl pasitikėjimo IR identifikavimu ir kiekybiniu įvertinimu.IR izoformų ekspresija SF3B1-K700E ir SF3B1-WT buvo kiekybiškai įvertinta remiantis nanoporų sekomis, atskleidžiant visuotinį IR izoformų reguliavimą SF3B1-K700E .
4 pav. Žemės ūkio intensyvumas ir tinklo ryšys trijose ūkininkavimo sistemose (A ir B);Atsitiktinė miško analizė (C) ir ryšys tarp žemės ūkio intensyvumo ir AMF kolonizacijos (D)
3 pav. Intronų nuomos įvykiai yra labiau reguliuojami CLL SF3B1-K700E
Technologijos
„Nanopore“ ilgai skaityta seka
Nanoporų sekvenavimas yra vienos molekulės realaus laiko elektrinio signalo sekos nustatymo technologija.
Ddvigrandė DNR arba RNR prisijungs prie nanoporinio baltymo, įterpto į bioplėvelę, ir išsivynioja po motorinio baltymo švinu.
DNA / RNR grandinės tam tikru greičiu praeina per nanoporų kanalo baltymą, veikiant įtampos skirtumui.
Molekulės generuoja skirtingus elektrinius signalus pagal cheminę struktūrą.
Rsekų aptikimas realiuoju laiku pasiekiamas baziniu iškvietimu.
Viso ilgio transkripto sekos atlikimas
√ Duomenų prisotinimas
Norint pasiekti panašų duomenų prisotinimą, reikia 7 kartus mažiau nuskaityti.
√ Nuorašo struktūros identifikavimas
Įvairių struktūrinių variantų identifikavimas su konsensusu nuskaitant visą kiekvieno nuorašo ilgį
√ Nuorašo lygio diferencinė analizė - Atskleiskite pokyčius, kuriuos slepia trumpi skaitymai
Nuoroda
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV ir kt.Lėtinės limfocitinės leukemijos SF3B1 mutacijos viso ilgio nuorašo apibūdinimas atskleidžia sumažėjusį sulaikytų intronų reguliavimą [J].Gamtos komunikacijos.
Technika ir svarbiausi dalykai siekia pasidalyti naujausiomis sėkmingomis įvairių didelio našumo sekos nustatymo technologijų taikymomis įvairiose tyrimų srityse, taip pat puikiomis eksperimentinio dizaino ir duomenų gavybos idėjomis.
Paskelbimo laikas: 2022-08-08