VISO GENOMO ATSAKYMAS
SARS-CoV-2 genomikos stebėjimas atskleidžia Nsp1 delecijos variantą, kuris moduliuoja I tipo interferono atsaką
Nanopore |Iliumina |Viso genomo sekos nustatymas |metagenomika |RNR-Seq |Sangeris
Šiame tyrime „Biomarker Technologies“ suteikė techninę pagalbą dėl mėginių sekos nustatymo.
Pabrėžia
1.SARS-CoV-2 genomo sekos nustatymas ir filogenetinė analizė nustato 35 pasikartojančias mutacijas, įskaitant 31 SNP ir 4 indelius.
2. Ryšys su 117 klinikinių fenotipų atskleidžia potencialiai
svarbios mutacijos.
∆500-532 Nsp1 koduojančiame regione koreliuoja su žemesniu virusu
3.krovos ir serumo IFN-β.
4. Viruso izoliatai su ∆500-532 mutacija sukelia mažesnį IFN-I
atsakas užkrėstose ląstelėse.
Eksperimentinis dizainas
Pasiekimai
1. COVID-19 epidemiologinė ir genominė priežiūra
Klinikiniai duomenys buvo renkami Sičuano provincijoje, Kinijoje per protrūkio laikotarpį nuo 2020 m. sausio 22 d. iki 2020 m. vasario 20 d. Sičuane qPCR tyrimais patvirtinti iš viso 538 COVID-19 atvejai, iš kurių 28,8 % buvo iš provincijos. kapitalo.Patvirtintų atvejų Sičuane padaugėjo eksponentiškai, o aukščiausią tašką pasiekė sausio 30 d.Be to, duomenys patvirtino, kad socialinis atsiribojimas gali būti pagrindinis veiksnys užkertant kelią viruso plitimui.
1 pav. Epidemiologinis COVID-19 tyrimas Sičuano provincijoje, Kinijoje
2. SARS-CoV-2 genomo konstrukcija ir variantų identifikavimas
Taikant daugialypį PGR amplifikaciją, po kurios seka nanoporų seka, iš viso buvo sukurta 310 beveik arba iš dalies pilnų genomų iš 248 pacientų, kurių maždaug.80 % genomų nuskaityta 10 kartų (vidutinis gylis: 0,39 M nuskaitymo mėginyje).
2 pav. Kiekvieno varianto dažnis Sičuano kohortoje
Iš SARS-CoV-2 genomų iš viso buvo identifikuoti 104 SNP ir 18 indelių, kuriuose 31 SNP ir 4 Indels buvo nustatyti kaip pasikartojantys genetiniai variantai.Palyginus juos su 169 mėginiais iš Uhano ir su 81 391 aukštos kokybės viešojo genomo seka GISAID, 29 iš 35 rastų variantų buvo pateikti kituose žemynuose.Pažymėtina, kad keturi variantai, įskaitant ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 ir T13243C, buvo tik Sičuane ir Uhane, o jų nėra GISAID duomenyse, o tai rodo, kad labai tikėtina, kad šie variantai buvo improvizuoti iš Uhano, kurie atitinka pacientų kelionių įrašai.
Evoliucinė analizė naudojant didžiausios tikimybės (ML) metodą ir Bajeso molekulinio laikrodžio metodus buvo apdorota naudojant 88 naujus virusus iš Sičuano ir 250 kuruojamų genomų iš kitų regionų.Genomai su ∆500-532 (delecijos Nsp1 koduojančiame regione) buvo retai pasiskirstę filogenetiniame medyje.Nsp1 variantų haplotipo analizė nustatė 5 iš jų iš kelių miestų.Šie rezultatai rodo, kad ∆500-532 atsirado keliuose miestuose ir gali būti kelis kartus importuotas iš Uhano.
2 pav. Pasikartojantys genetiniai variantai ir filogenetinė analizė SARS-CoV-2 genomuose
3. Pasikartojančių genetinių variantų susiejimas su klinikinėmis reikšmėmis
117 klinikinių fenotipų buvo susiję su COVID-19 sunkumu, iš kurių 19 su sunkumu susijusių fenotipų buvo suskirstyti į sunkius ir nesunkius požymius.Ryšys tarp šių bruožų ir 35 pasikartojančių genetinių variantų buvo vizualizuotas dviejų grupių šilumos žemėlapyje.Į GSEA panašaus reitingo sodrinimo analizė parodė, kad ∆500-532 neigiamai koreliuoja su ESR, serumo IFN-β ir CD3+CD8+ T ląstelių skaičiumi kraujyje.Be to, qPCR tyrimai parodė, kad pacientai, užsikrėtę virusu, turinčiu ∆500-532, turėjo didžiausią Ct vertę, ty mažiausią viruso kiekį.
3 pav. 35 pasikartojančių genetinių variantų sąsajos su klinikiniais fenotipais
4. Su virusinėmis mutacijomis susijusių klinikinių fenotipų patvirtinimas
Siekiant suprasti ∆500-532 įtaką Nsp1 funkcijoms, HEK239T ląstelės buvo transfekuotos plazmidėmis, ekspresuojančiomis viso ilgio, WT Nsp1 ir mutantines formas su delecija.Kiekvienos apdorotos HEK239T ląstelės transkripto profiliai buvo apdoroti PCA analizei, parodydami, kad delecijos mutantai susibūrė santykinai arčiau ir žymiai skyrėsi nuo WT Nsp1.Genai, kurie buvo žymiai sureguliuoti mutantuose, daugiausia buvo praturtinti „peptidų biosintezės / medžiagų apykaitos procesu“, „ribonukleoproteinų komplekso biogeneze“, „baltymų nukreipimu į membraną / ER“ ir kt. Be to, dvi ištrynimai parodė skirtingą WT ekspresijos modelį.
4 pav. HEK239T ląstelių, transfekuotų WT Nsp1 ir su delecijomis, transkripto analizė
Ištrynimų įtaka IFN-1 atsakui taip pat buvo patikrinta per daug išreikšto tyrimo metu.Įrodyta, kad visos išbandytos delecijos sumažina IFN-1 atsaką transfekuotose HEK239T ir A549 ląstelėse tiek transkripto, tiek baltymų lygiu.Įdomu tai, kad delecijose žymiai sumažėję genai buvo praturtinti „gynybos atsaku į virusą“, „viruso genomo replikacija“, „RNR polimerazės II transkripcijos reguliavimu“ ir „atsakymu į I tipo interferoną“.
5 pav. Interferono signalizacijos kelių reguliavimas ∆500-532 mutantuose
Šiame tyrime šių ištrynimų poveikį virusui dar patvirtino virusinės infekcijos tyrimai.Virusai su tam tikrais mutantais buvo išskirti iš klinikinių mėginių ir užkrėsti Calu-3 ląstelėmis.Išsamius virusinės infekcijos tyrimo rezultatus galima perskaityti straipsnyje.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Nuoroda
Lin J, Tang C, Wei H ir kt.Genominis SARS-CoV-2 stebėjimas atskleidžia Nsp1 delecijos variantą, kuris moduliuoja I tipo interferono atsaką [J].Ląstelės šeimininkas ir mikrobas, 2021 m.
Naujienos ir svarbiausi dalykai siekia pasidalyti naujausiais sėkmingais atvejais su „Biomarker Technologies“, užfiksuoti naujus mokslo laimėjimus ir svarbius tyrimo metu taikytus metodus.
Paskelbimo laikas: 2022-06-06