METAGENOMISCH
Komplett, zougemaach bakteriell Genome vu Mikrobiome mat Nanopore Sequenzéierung
Nanopore Sequencing |Metagenomics |MAG |Bakteriell Genom Circulariséierung |Darm Mikrobiota
Highlights
1.Eng nei Method fir laang Fragmenter vun DNA ze extrahieren gouf an dëser Etude presentéiert, déi Extraktioun vu Mikrogramm vu purer HMW DNA erreecht huet, gëeegent fir laang gelies Sequenzéierung vun 300 mg Hocker
2.En Assemblée Workflow, Dréibänk, gouf an dëser Etude agefouert, wou MAGs duerch laang Liesungen a korrigéiert goufen duerch kuerz Liesungen.
3.Dréibänk gouf duerch Spottmëschung bewäert.7 vun 12 Bakterien goufen erfollegräich an eenzel contigs versammelt an 3 sech a véier oder manner contigs versammelt.
4.Lathe war weider op Hocker Echantillon applizéiert, déi generéiert 20 circularized genomes, dorënner Prevotella copri a Kandidat Cibiobacter sp., déi bekannt waren fir räich un mobilen geneteschen Elementer ze sinn.
Main Erreeche
Extraktiounsprotokoll fir HWM DNA
Laang gelies Sequenzéierungsbaséiert Darm metagenomesch Studien goufe laang vun der Härtheet gelidden beim Extrait vun héichmolekulare Gewiicht (HMW) DNA aus Hocker.An dëser Etude gouf en Enzym-baséiert Extraktiounsprotokoll agefouert fir extensiv Scheren ze vermeiden duerch Perlenschlag an traditionelle Methoden.Wéi an der folgender Figur gewisen, goufen d'Proben als éischt mat engem Cocktail vun Enzymen behandelt, dorënner lytesch Enzym, MetaPolyzyme, etc., fir Zellmaueren ze degradéieren.Verëffentlecht DNA gouf vum Phenol-chloroform System extrahéiert, gefollegt vun Proteinase K an RNase A Verdauung, Kolonnbaséiert Reinigung an SPRI Gréisst Auswiel.Dës Method huet et fäerdeg bruecht Mikrogramme vun HMW DNA aus 300 m Hocker z'erreechen, déi laang gelies Sequenzéierungsfuerderunge souwuel wat Qualitéit a Quantitéit ugeet.
Figur 1. HWM DNA Extraktioun Schema
Schema Flux vun Dréibänk
Wéi an der folgender Figur beschriwwen, enthält Dréibänk bestehend Prozess vun Matière basecalling Prozess benotzt Guppy.Zwee laang gelies Versammlungen ginn dann vum Flye a Canu getrennt produzéiert, gefollegt vu falschen Assemblée Detektioun an Entfernung.Déi zwee Ënnerversammlungen gi mat Quickmerge fusionéiert.Beim Fusioun gi grouss Versammlungen um Megabaseniveau dann op Circulariséierung gepréift.Duerno gëtt d'Konsensverfeinerung iwwer dës Versammlungen mat kuerze Liesungen veraarbecht.Final versammelt bakteriell Genome gi veraarbecht fir endgülteg Mëssversammlung Detektioun an Entfernung.
Figur 2. Schema Flux vun Dréibänk Assemblée
Evaluatioun vun Dréibänk mat Mock Bakterien Mëschung
Eng Standard ATCC 12-Arten Mëschung aus Gram-positiven a Gram-negativen Bakterien gouf benotzt fir d'Performance vun der Nanopore Sequenzéierungsplattform a Dréibänk an der MAG Versammlung ze evaluéieren.Insgesamt 30,3 Gb Daten goufe vun der nanopore Plattform mat N50 vun 5,9 kb generéiert.Dréibänk gréisstendeels verbessert Assemblée N50 ze 1,6 ze 4-Fall Verglach mat anere laang-liesen Assemblée Handwierksgeschir an 2 ze 9-Fold Verglach zu hybridd Assemblée Handwierksgeschir.Vun 12 bakteriell genomes, siwen sech an eenzel contigs versammelt (Dorënner 3. Circos mat schwaarz Punkt).Dräi méi goufen a véier oder manner Contigs versammelt, an deenen déi onkomplett Versammlung 83% vum Genom an enger eenzeger Contig enthält.
Figur 3. Genom Versammlungen an engem definéiert 12-Arten bakteriell Mëschung
Uwendung vun Dréibänk an Hocker Echantillon
Dës Method gouf weider op mënschlech Hocker Echantillon applizéiert fir d'Identifikatioun vun den Organismen an d'Montagekontiguitéit mat existéierende Methoden, Lies-Wollek a Kuerzliesbaséiert Analyse ze vergläichen.Vun den dräi involvéierte Proben huet déi nei Enzym-baséiert Extraktioun op d'mannst 1 μg pro 300 mg Input Mass erausginn.Nanopore Sequenzéierung vun dësen HMW DNA generéiert laang Liesungen mat N50 vu 4.7 kb, 3.0kb respektiv 3.0kb.Notamment huet déi aktuell Method e grousst Potenzial bei der mikrobieller Detektioun gewisen am Verglach mat existente Methoden.Relativ méi héich Arten-Niveau Alpha Diversitéit gouf hei gewisen am Verglach mat Kuerzliesen a Lieswolleken.Desweideren, all Gattungen aus kuerz-liesen Analyse, och typesch lysis-resistente Gram-positiv Organismen, goufen duerch dës Method erëmfonnt.
Figur 4. Alpha Diversitéit an taxanomic Komponente bestëmmt vun Nanopore, kuerz-liesen a liesen-Cloud Methoden
Dréibänk huet vill méi laang ganz Assemblée N50 wéi kuerz-liesen a liesen-Wollek Assemblée, trotz engem dräi- bis sechs mol manner Input vun Matière Daten.Entworf Genome goufen duerch contig binning produzéiert, an deem d'Entworf an "Héichqualitéit" oder "deelweis" klasséiert goufen baséiert op Vollständegkeet, Kontaminatioun, Single-Copy Kär Genen, etc. Laang-liesen Assemblée gewisen vill méi héich contiguity zu manner Käschten Verglach ze kuerz-liesen a liesen-Cloud.
Figur 5. Pro Organismus Assemblée contiguity vun all Method
Ausserdeem ass déi aktuell Versammlungs Approche fäeg zouen, kreesfërmeg Genomen z'erreechen.An de Hocker Echantillon, aacht héich-Qualitéit, Single-contig Genome goufen zesummegefaasst a fënnef vun dësen erreecht percise circularization.Laang gelies Approche huet och beandrockend Kapazitéit gewisen fir repetitive Elementer an Genomen ze léisen.CirculariséiertP. copriGenom gouf vun dëser Approche generéiert, déi bekannt ass fir en héije Grad vun der Sequenzwidderhuelung ze enthalen.Déi bescht Assemblée vun dësem Genom duerch kuerz-liesen a liesen-Cloud iwwerschratt ni N50 vun 130 kb, och mat Ofdeckung Déift vun 4800X.Dës héich Kopie Zuel Elementer goufen voll duerch laang-liesen Approche geléist, déi dacks um Break Punkten vun kuerz-liesen oder liesen-Cloud Assemblée fonnt.Aner zougemaach Genom gouf an dëser Etude gemellt, déi gegleeft gouf Member vun kuerzem beschriwwenCibiobakterklaut.Fënnef putative Phage gouf an dëser zouener Versammlung identifizéiert, rangéiert vun 8,5 bis 65,9 kb.
Figur 6. Circos Diagramm vun zougemaach genomes vun P.copri an Cibiobacter sp.
Referenz
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Komplett, zougemaach bakteriell Genome vu Mikrobiome mat Nanopore Sequenzéierung.Natur Biotechnologie,38(6), 701-707.
Tech an Highlights zielt fir déi lescht erfollegräich Uwendung vu verschiddenen High-Throughput-Sequenzéierungstechnologien a verschiddene Fuerschungsarena ze deelen, souwéi genial Iddien am experimentellen Design an Datemining.
Post Zäit: Jan-07-2022