TRANSCRIPTOMISCH
Natur
KOMMUNIKATIOUNEN
Volllängt Transkriptkarakteriséierung vun der SF3B1 Mutatioun bei chronescher lymphozyter Leukämie verroden Downregulatioun vun erhale Intronen
Volllängt Transkriptiounen|Nanopore Sequenzen|Alternativ Isoform Analyse
Hannergrond
Somatic Mutatiounen am splicing Faktor SF3B1 gouf wäit gemellt mat verschiddene Cancers ze associéieren, dorënner chronescher lymphocytic Leukämie (CLL), uveal melanoma, Broscht Kriibs, etc.Wéi och ëmmer, Studien iwwer dës alternativ Splicingmuster si laang limitéiert op Eventniveau a Mangel u Wëssen iwwer Isoformniveau wéinst der Begrenzung vu kuerz gelies versammelt Transkriptiounen.Hei gouf d'Nanopore Sequenzéierungsplattform agefouert fir Volllängt Transkripter ze generéieren, déi d'Inverstigatioun op AS Isoformen erméiglechen.
Experimentell Design
Experimenter
Gruppéierung:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E Mutatioun);3. Normal B-Zellen
Sequenzéierungsstrategie:MinION 2D Bibliothéik sequencing, PromethION 1D Bibliothéik sequencing;kuerz liesen Daten aus selwechten Echantillon
Sequenzéierungsplattform:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatesch Analyse
Resultater
AGanzen 257 Millioune liesen sech aus 6 CLL Echantillon an 3 B-Zellen generéiert.Am Duerchschnëtt vun 30,5% vun dëse Liesungen goufen als Volllängt Transkriptiounen identifizéiert.
Full-Längt Alternativ Isoform Analyse vun RNA (FLAIR) gouf entwéckelt fir eng Rei vu High-Vertrauensisoformen ze generéieren.FLAIR kann zesummegefaasst ginn wéi:
Nanopore liest Ausriichtung: identifizéieren allgemeng Transkriptstruktur baséiert op Referenzgenom;
Splice Kräizung Korrektur: korrekt Sequenz Feeler (rout) mat splice Site vun entweder annotéiert introns, introns aus kuerz-liesen Donnéeën oder béid;
Collapse: resüméiert representativ Isoformen op Basis vu Splitverbindungsketten (Éischt-Pass-Set).Wielt High-Confidence Isofrom baséiert op der Unzuel vun ënnerstëtzende Liesungen (Schwell: 3).
Figur 1. FLAIR Analyse fir voll Lenth Isoformen ze identifizéieren, déi mat der SF3B1 Mutatioun an CLL verbonne sinn
FLAIR identifizéiert 326,699 héichvertraulech gespléckt Isoformen, 90% vun deenen nei Isoformen sinn.Déi meescht vun dësen onannotéierten Isoforme goufe fonnt als nei Kombinatioune vu bekannte Splitverbindungen (142,971), während de Rescht Roman Isoformen entweder behalen Intron (21,700) oder Roman Exon (3594) enthalen.
Long-liese Sequenzen erméiglechen d'Identifikatioun vu mutanten SF3B1-K700E-verännert Splice Siten op Isoform-Niveau.35 Alternativ 3'SSs an 10 Alternativ 5'SSs goufen fonnt bedeitend differenziell spliced tëscht SF3B1-K700E an SF3B1-WT.33 vun de 35 Ännerunge goufen nei duerch laang gelies Sequenzen entdeckt.An Nanopore Daten ass d'Verdeelung vun der Distanz tëscht SF3B1-K700E-verännert 3'SSs zu kanonesche Site Peaks ongeféier -20 bp, wat wesentlech vun enger Kontrollverdeelung ënnerscheet, ähnlech wéi wat an CLL Kuerzliessequenzen gemellt gouf.Isoforms vun ERGIC3 Gentherapie goufen analyséiert, wou e Roman isoform mat der proximal splice Site mat méi reichend an SF3B1-K700E fonnt goufen.Béid proximal an distal 3'SS ware mat ënnerscheeden AS Mustere verbonne mat multiple Isoformen.
Figur 2. Alternativ 3′ Splicing Mustere mat Nanopore Sequenzéierungsdaten identifizéiert
IR Event Benotzungsanalyse ass laang limitéiert a kuerz Liesbaséiert Analyse wéinst Vertrauen an IR Identifikatioun a Quantifikatioun.Ausdrock vun IR Isoformen an SF3B1-K700E an SF3B1-WT goufen quantifizéiert baséiert op Nanopore Sequenzen, déi eng global Down-Regulatioun vun IR Isoformen an SF3B1-K700E weisen.
Figur 4. Landwirtschaft Intensitéit an Reseau Konnektivitéit iwwer dräi Landwirtschaft Systemer (A an B);Zoufälleg Bësch Analyse (C) a Relatioun tëscht landwirtschaftlech Intensitéit an AMF Kolonisatioun (D)
Figur 3. Intron Rententiounsevenementer si méi staark downreguléiert am CLL SF3B1-K700E
Technologie
Nanopore Long-read Sequencing
NAnopore Sequencing ass eng eenzeg Molekül Echtzäit elektresch Signal Sequencing Technologie.
DOuble-stranded DNA oder RNA binden un nanoporöse Proteinen, déi am Biofilm agebonne sinn an ënner der Leedung vum Motorprotein entspanen.
DNA / RNA Strécke passéieren duerch Nanopore Kanalprotein mat gewëssen Taux ënner der Handlung vum Spannungsdifferenz.
Molecules generéieren verschidden elektresch Signaler no chemescher Struktur.
Real-Zäit Detektioun vu Sequenzen gëtt duerch Basis Uruff erreecht.
Leeschtung vu voller Längt Transkriptom Sequenzéierung
√ Daten Saturatioun
7-fach manner Liesen erfuerderlech fir vergläichbar Datensättigung z'erreechen.
√ Transkript Struktur Identifikatioun
Identifikatioun vun diversen strukturelle Varianten mat Konsens voll Längt Liesung vun all Transkript
√ Transkript-Niveau Differential Analyse -Entdeckt Ännerungen verstoppt duerch kuerz Liesungen
Referenz
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Volllängt Transkriptkarakteriséierung vun der SF3B1 Mutatioun bei chronescher lymphozyter Leukämie verroden Downregulatioun vun erhale Intronen [J].Natur Kommunikatiounen.
Tech an Highlights zielt fir déi lescht erfollegräich Uwendung vu verschiddenen High-Throughput-Sequenzéierungstechnologien a verschiddene Fuerschungsarena ze deelen, souwéi genial Iddien am experimentellen Design an Datemining.
Post Zäit: Jan-08-2022