Volllängt mRNA Sequencing -PacBio

De neieVolllängt Transkriptom Sequenzéierung, och bekannt alsDe neieIso-Seq hëlt d'Virdeeler vum PacBio Sequenzer a Lieslängt, wat d'Sequenzéierung vu Volllängt cDNA Molekülen ouni Pausen erméiglecht.Dëst vermeit komplett Feeler generéiert an Transkriptversammlungsschrëtt a konstruéiert unigen Sets mat Isoform-Niveau Opléisung.Dës Unigene Sets liwwert mächteg genetesch Informatioun als "Referenzgenom" um Transkriptom-Niveau.Zousätzlech, kombinéiert mat der nächster Generatioun Sequenzéierungsdaten, erméiglecht dëse Service eng korrekt Quantifikatioun vum Isoform-Niveau Ausdrock.

Plattform: PacBio Sequel II

Bibliothéik: SMRT Bell Bibliothéik

Kontaktéiert eis

Service Detailer

Demo Resultater

Fall Studie

Service Virdeeler

● Direkt Ausliesen vu Volllängt cDNA Molekül vum 3'-Enn op 5'-Enn

● Iso-Form Niveau Resolutioun an Sequenz Struktur

● Transkriptiounen mat héijer Genauegkeet an Integritéit

● Héich kompatibel mat vaiours Arten

● Grouss Sequenzéierungskapazitéit mat 4 PacBio Sequel II Sequenzéierungsplattformen ausgestatt

● Héich erfuerene mat iwwer 700 Pacbio-baséiert RNA-Sequenzéierungsprojeten

● BMKCloud-baséiert Resultat Liwwerung: Personnaliséierten Datemining verfügbar op der Plattform.

● After-sale-Servicer gëlteg fir 3 Méint nom Ofschloss vum Projet

Service Spezifikatioune

Plattform: PacBio Sequel II

Sequencing Bibliothéik: Poly A-beräichert mRNA Bibliothéik

Recommandéiert Datenaustausch: 20 Gb / Probe (ofhängeg vun der Art)

FLNC (%): ≥75%

*FLNC: Volllängt net-chimeresch Transcipte

Bioinformatik Analysen

● Raw Datenveraarbechtung

● Transkript Identifikatioun

● Sequenzstruktur

● Ausdrock Quantifikatioun

● Funktioun Annotatioun

Prouf Ufuerderunge a Liwwerung

Sample Ufuerderunge:

Nukleotiden:

Konzentratioun (ng/μl)

Betrag (μg)

Rengheet

Integritéit

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Limitéiert oder keng Protein oder DNA Kontaminatioun op Gel gewisen.

Fir Planzen: RIN≥7,5;

Fir Déieren: RIN≥8.0;

5.0≥ 28S/18S≥1.0;

limitéiert oder keng Basislinn Héicht

Tissue: Gewiicht (dréchen):≥1 g
* Fir Tissue méi kleng wéi 5 mg, empfeelen mir Flash gefruerene (a flëssege Stickstoff) Tissueprobe ze schécken.

Zell Suspension:Zellzuel = 3×10⁶- 1 × 10⁷
* Mir recommandéieren gefruer Zell lysate ze Schëff.Am Fall datt Zelle méi kleng wéi 5 × 10 zielt⁵, Flash gefruer a flëssege Stickstoff ass recommandéiert, wat am léifsten fir Mikro Extraktioun ass.

Bluttprouwen:Volume ≥1 ml

Mikroorganismen:Mass ≥ 1 g

Recommandéiert Sample Liwwerung

Container:
2 ml Zentrifugerröhr (Zinnfolie ass net recommandéiert)
Probe Etikettéierung: Grupp + replizéieren zB A1, A2, A3;B1, B2, B3...

Sendung:

1. Dréchent Äis: Echantillon mussen a Poschen gepackt ginn an an dréchen Äis begruewe ginn.
2. RNAstable Réier: RNA Echantillon kënnen an RNA Stabiliséierung Rouer gedréchent ginn (zB RNAstable®) an an Raumtemperatur geschéckt.

Service Work Flow

Experimenter Design

Echantillon Liwwerung

RNA Extraktioun

Bibliothéik Bau

Sequenzéieren

Donnéeën Analyse

No-Verkaf Servicer

virdrun: Eukaryotesch mRNA Sequencing-Illumina

Nächste: Voll-Längt mRNA Sequencing-Nanopore

1.FLNC Längt Verdeelung

Längt vun der voller Längt net-chimerescher Lies (FLNC) weist d'Längt vum cDNA an der Bibliothéikskonstruktioun un.FLNC Längt Verdeelung ass en entscheedende Indikator bei der Evaluatioun vun der Qualitéit vum Bibliothéikskonstruktioun.

mRNA-FLNC-liesen-Längt-Verdeelung

FLNC liesen Längt Verdeelung

2.Complete ORF Regioun Längt Verdeelung

Mir benotzen TransDecoder fir Proteinkodéierungsregiounen an entspriechend Aminosaier Sequenzen virauszesoen fir unigen Sets ze generéieren, déi komplett net-redundant Transkriptinformatioun an all Echantillon enthält.

mRNA-Komplett-ORF-Längt-Verdeelung

Komplett ORF Regioun Längt Verdeelung

3.KEGG Wee Beräicherung Analyse

Differenziell ausgedréckte Transkripter (DETs) kënnen identifizéiert ginn andeems NGS-baséiert RNA Sequenzéierungsdaten op voll Längt Transkriptsets generéiert duerch PacBio Sequenzéierungsdaten ausgeriicht ginn.Dës DETs kënne weider fir verschidde funktionell Analyse veraarbecht ginn, zB KEGG Pathway Beräicherungsanalyse.

mRNA-DEG-KEGG-Wee-Beräicherung

DET KEGG Wee Beräicherung -Dot Komplott

BMK Fall

D'Entwécklungsdynamik vum Populus Stamm Transkriptom

Verëffentlecht: Planz Biotechnologie Journal, 2019

Sequenzéierungsstrategie:
Sammel Sammlung:Stammregiounen: Spëtzt, éischt Internode (IN1), zweet Internode (IN2), drëtt Internode (IN3), Internode (IN4) an Internode (IN5) vum Nanlin895
NGS-Sequenz:RNS vu 15 Individuen goufen als eng biologesch Prouf zesummegefaasst.Dräi biologesch Replikate vun all Punkte goufen fir NGS Sequenz veraarbecht
TGS-Sequenz:Stamm Regiounen goufen an dräi Regiounen ënnerdeelt, dh Spëtzt, IN1-IN3 an IN4-IN5.All Regioun gouf fir PacBio Sequenzéierung mat véier Aarte vu Bibliothéiken veraarbecht: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb an 3-10 kb.

Schlëssel Resultater

1.A Ganzen 87150 voll-Längt Transkriptiounen goufen identifizéiert, an deem, 2081 Roman Isoforms an 62058 Roman alternativ spliced isoforms identifizéiert goufen.
2.1187 lncRNA an 356 Fusioun Genen goufen identifizéiert.
3.Vum primäre Wuesstum zum sekundäre Wuesstum, 15838 differentiell ausgedréckte Transkriptiounen aus 995 differentiell ausgedréckte Genen goufen identifizéiert.An all DEG waren 1216 Transkriptiounsfaktoren, déi meescht vun deenen nach net gemellt goufen.
4.GO Beräicherung Analyse verroden Wichtegkeet vun Zell Divisioun an Oxidatioun-Reduktioun Prozess am Primärschoul a Secondaire Wuesstem.