МЕТАГЕНОМИКА
Нанопора секвенирлөөнүн жардамы менен микробиомалардан толук, жабык бактериялык геномдор
Nanopore Sequencing |Метагеномика |MAGs |Бактериялык геномдун циркуляризациясы |Ичеги микробиотасы
Маанилүү учурлар
1. Бул изилдөөдө ДНКнын узун фрагменттерин экстракциялоонун жаңы ыкмасы сунушталды, ал 300 мг заңдан узак окуу үчүн ылайыктуу таза, HMW ДНКнын микрограммын экстракциялоого жетишкен.
2. Бул изилдөөдө монтаждоо иш процесси, Токарь киргизилген, анда MAG узак окуу менен чогулуп, кыска окуулар менен оңдолгон.
3. Токарь жасалма аралашма менен бааланды.12 бактериянын 7си ийгиликтүү бир контигтерге жана 3ү төрт же андан азыраак контигтерге чогулду.
4.Токарь андан ары 20 айланма геномду, анын ичинде Prevotella copri жана талапкер Cibiobacter sp.мобилдик генетикалык элементтерге бай экендиги менен белгилүү болгон.
Негизги жетишкендик
HWM ДНК үчүн экстракция протоколу
Узак окулган секвенирлөөнүн негизинде ичегидеги метагеномикалык изилдөөлөр заңдан жогорку молекулярдык салмактагы (HMW) ДНКны бөлүп алууда катуулыктан көптөн бери кыйналып келген.Бул изилдөөдө, салттуу ыкмалар менен мончокторду сабап, кеңири кыркууну болтурбоо үчүн ферментке негизделген экстракция протоколу киргизилген.Төмөнкү сүрөттө көрсөтүлгөндөй, үлгүлөр адегенде ферменттердин коктейли менен, анын ичинде литикалык фермент, МетаПолизим ж.б. менен иштетилген.Чыгарылган ДНК фенол-хлороформ системасы, андан кийин протеиназа K жана RNase A сиңирүү, колоннага негизделген тазалоо жана SPRI өлчөмүн тандоо аркылуу алынган.Бул ыкма 300 м отургучтан микрограмм HMW ДНКсын алууга жетишти, ал сапаты жана саны боюнча көптөн бери окулуучу секвенирлөө талаптарын аткарат.
Сүрөт 1. HWM ДНКсын экстракциялоо схемасы
Токарлык станоктун схемасы
Төмөнкү сүрөттө сүрөттөлгөндөй, Токарь станогунда Guppy аркылуу чийки базалык чакыруу процессинин учурдагы процесси камтылган.Узак окулган эки монтажды Flye жана Canu өзүнчө чыгарат, андан кийин туура эмес монтажды аныктоо жана алып салуу.Эки кичи ассамблея тез бириктирүү менен бириктирилген.Бириктирилгенден кийин, мегабаза деңгээлиндеги чоң жыйындар айлануу үчүн текшерилет.Андан кийин, бул жыйындар боюнча консенсус тактоо кыскача окуу менен иштелип чыгат.Акыркы чогултулган бактериялык геномдор акыркы ката монтаждоону аныктоо жана алып салуу үчүн иштетилет.
2-сүрөт. Токарлык станоктордун агымынын схемасы
жасалма бактерия аралашмасы менен токарь баалоо
Грам-оң жана грам-терс бактерияларды камтыган стандарттуу ATCC 12 түрлүү аралашмасы MAG монтажында нанопор секвенирлөө платформасынын жана станоктун иштешин баалоо үчүн колдонулган.Жалпысынан 30,3 Гб маалымат 5,9 кб N50 менен nanopore платформасы тарабынан түзүлгөн.Токарь N50 монтажын көптөн бери окуган башка аспаптарга салыштырмалуу 1,6дан 4 эсеге чейин жана гибриддик монтаждоо куралдарына салыштырмалуу 2ден 9 эсеге чейин жакшыртты.12 бактериялык геномдун жетөө бир контигге чогултулган (3-сүрөт. Кара чекит менен циркос).Дагы үчөө төрт же андан азыраак контигге чогулду, анда эң толук эмес жыйында бир контигде геномдун 83% камтылган.
3-сүрөт. Белгиленген 12 түрлүү бактериялык аралашмадагы геномдук жыйындар
Токарлык станокту табурет үлгүлөрүндө колдонуу
Бул ыкма андан ары организмди идентификациялоо жана жамааттын туташуулугун учурдагы методдорго, окуу-булут жана кыска окууга негизделген анализге салыштыруу үчүн адамдын заңынын үлгүлөрүнө колдонулган.Тартылган үч үлгүдөн, ферментке негизделген жаңы экстракция 300 мг кириш массасынан кеминде 1 мкг берди.Бул HMW ДНКсынын нанопора секвенциясы N50 менен 4,7 кб, 3,0 кб жана 3,0 кб менен узак окууларды түздү.Белгилей кетчү нерсе, азыркы метод микробдорду аныктоодо учурдагы методдорго салыштырмалуу чоң потенциалды көрсөткөн.Бул жерде кыска окуу жана окуу булутуна караганда салыштырмалуу жогору түр деңгээлиндеги альфа ар түрдүүлүгү көрсөтүлгөн.Мындан тышкары, кыска окуу анализинин бардык тукумдары, ал тургай, адатта, лизиске туруктуу Грам-оң организмдер да, ушул ыкма менен калыбына келтирилген.
Сүрөт 4. Nanopore, кыска окуу жана окуу-булут ыкмалары менен аныкталган Alpha ар түрдүүлүгү жана таксомикалык компоненттер
Токарь N50 бүтүн монтажын кыска окууга жана окуу булуттуу монтажга караганда алда канча узагыраак берди, чийки маалыматтардын үч-алты эсе аз киргизилишине карабастан.Долбоор геномдору контиг менен бириктирүү жолу менен өндүрүлгөн, мында чиймелер толуктугуна, булгануусуна, бир копиялуу өзөк гендерине ж.б. негизинде “жогорку сапаттагы” же “жарым-жартылай” болуп классификацияланган. кыска-окуу жана окуу-булут.
5-сүрөт. Ар бир ыкманын организмге биригүүсү
Мындан тышкары, азыркы жамааттык ыкма жабык, тегерек геномдорду берүүгө жөндөмдүү.Заъдын үлгүлөрүндө сегиз жогорку сапаттагы, бир контигдүү геном чогултулуп, алардын бешөө так айланууга жетишкен.Узак окуу ыкмасы геномдордогу кайталануучу элементтерди чечүүдө таасирдүү жөндөмдү көрсөттү.ТегеректелгенP. copriгеном ырааттуу кайталануу жогорку даражасын камтыган белгилүү болгон бул ыкма менен түзүлгөн.Бул геномдун кыска окуу жана окуу-булут аркылуу эң мыкты жыйындысы 4800X камтуу тереңдиги менен 130 кб N50 эч качан ашкан эмес.Көчүрүү саны жогору болгон бул элементтер узак окуу ыкмасы менен толугу менен чечилген, алар көбүнчө кыска окуу же окуу булут жыйындарынын бузулуу чекиттеринде табылган.Бул изилдөөдө дагы бир жабык геном билдирилди, ал жакында сүрөттөлгөн геномдун мүчөсү деп эсептелгенCibiobacterклад.Бул жабык ассамблеяда 8,5тен 65,9 кб чейин болгон беш болжолдуу фаг аныкталган.
Сүрөт 6. P.copri жана Cibiobacter sp. жабык геномдорунун циркос диаграммасы.
Шилтеме
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Нанопора секвенирлөөнүн жардамы менен микробиомалардан толук, жабык бактериялык геномдор.Жаратылыш биотехнологиясы,38(6), 701-707.
Tech and Highlights ар кандай изилдөө ареналарында ар кандай жогорку өтүмдүү секвенирлөө технологияларын эң акыркы ийгиликтүү колдонууну, ошондой эле эксперименталдык дизайндагы жана маалыматтарды казып алуудагы эң сонун идеяларды бөлүшүүгө багытталган.
Посттун убактысы: 07-январь 2022