АДАМ ГЕНОМИКАСЫ
жаратылыш генетикасы
Узак окуу ырааттуулугу нейрондук ядролук инклюзия оорусу менен байланышкан NOTCH2NLCдеги GGC кайталануу кеңейүүлөрүн аныктайт
ONT resequecing |Illumina |Бүтүндөй экзома секвенирлөө |CRISPR-Cas9 ONT максаттуу секвенирлөө |RNA-seq |ONT 5mC метилденүү чалуу
Маанилүү учурлар
1. Чоң NIID үй-бүлөсүндө байланышты талдоо аркылуу эки байланышкан аймак аныкталган.
2.ONT негизинде узак окуу ырааттуулугу жана Cas-9 ортомчу байытуу ONT ырааттуулугу NIID, GGC кайталап кеңейтүү мүмкүн болгон генетикалык себебин ачты 5 ′ UTR боюнча NOTCH2NLC.Бул изилдөө биринчи жолу сегменттик кайталоо аркылуу пайда болгон адамга тиешелүү гендерде кайталанган кеңейүүлөрдү билдирди.
3.RNA ырааттуулугу NOTCH2NLC ичинде GGC кайталануучу кеңейүү аймактарынын башында же ичинде анормалдуу антисенс транскрипттерин ачты.
Фон
Neuronal intranuclear inclusion оорусу (NIID) - борбордук жана перифериялык нерв системаларында эозинофильдик гиалиндик ядролук кошулмалардын болушу менен мүнөздөлгөн прогрессивдүү жана өлүмгө алып келген нейродегенеративдик оору.Анын өтө өзгөрүлмө клиникалык көрүнүштөрү теринин биопсиясы киргизилгенге чейин диагностикада чоң кыйынчылыктарды жаратат.Бирок, гистопатологияга негизделген ыкмалар дагы эле NIIDдин генетикалык түшүнүгүн талап кылган туура эмес диагностикадан жапа чегип келет.
Жетишкендиктер
Байланыш анализи
SHort-read секвенциясына негизделген бүтүндөй геномдун секвенциясы (WGS) жана бүт экзома секвенциясы (WES) чоң NIID үй-бүлөсүндө (13 жабыр тарткан жана 7 таасирленбеген мүчө) аткарылган.Бул маалыматтардан алынган SNPs боюнча байланышты талдоо эки гана байланышкан аймакты аныктады: 1p36.31-p36.22 боюнча 3,5 Мб аймак (максималдуу LOD = 2,32) жана 1p22.1-q21.3 боюнча 58,1 Мб аймак (максималдуу LOD: 4,21) ).Бирок, бул байланышкан аймактарда эч кандай патогендик SNPs же CNV аныкталган эмес.
NOTCH2NLCде GGC кайталануучу кеңейүү
Nанопордун негизинде секвенирлөө 8 үй-бүлөдөгү 13 жабыр тарткан жана 4 таасирленбеген мүчөдө иштетилди (башка бир жабыр тарткан мүчө Pacbio узак окуу секвенирлөө платформасы тарабынан тизилген.).Узак окуу маалыматтары 58.1 Mb байланышкан аймакка NOTCH2NLC генинин картасынын 5′ UTRинде GGC кайталануучу оору менен байланышкан кеңейтүүлөрдү көрсөттү (1-сүрөт).Бул кайталануучу кеңейүүлөр RP-PCR тарабынан сыналган бардык 40 спорадик NIID учурларында да аныкталган.
CNOTCH2NLC кайталоодо (100 X-1,795 X) жогорку окуу камтуулугуна жетүү үчүн нанопур платформасында as-9 ортомчу максаттуу ырааттуулук колдонулган.Бул консенсус ырааттуулугу GGC кайталануучу кеңейтүүлөр боюнча мурунку жыйынтыктар менен жакшы макул болду.Мындан тышкары, {(GGA)n (GGC)n}n кайталануусу алсыздык басымдуулук кылган фенотип үчүн потенциалдуу генетикалык маркер катары аныкталган (2-сүрөт).
Figure 1. NOTCH2NLC изоформаларынын 1 экзонунда аныкталган ооруга байланыштуу кайталанган кеңейүү.
Сүрөт 2. NPTCH2NLC консенсус ырааттуулугу (*) же алсыздыгы басымдуулук кылган фенотипсиз NIID пациенттеринде кайталанат
NOTCH2NL гендери адамдын мээсинин эволюциясында жана нейрологиялык ооруларда маанилүү ролду ойнойт деп эсептелген адамга мүнөздүү гендер.Бирок, үч NOTCH2 менен байланышкан гендер (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB жана NOTCH2NLC) > 99,1% ырааттуулугу менен адам геномунун акыркы жыйынына чейин чечилген эмес.Нанопур платформасында синтезсиз жана узак окуу ырааттуулугу 100% GCге бай жогорку окшоштуктар жана (GGC)n кайталануу аймактарын чечүүдө көрүнүктүү артыкчылыктарды көрсөттү.
NOTCH2NLCде GGC кайталануучу кеңейүү
Tранскриптомдун ырааттуулугу 2 жабыркаган жана 2 таасирленбеген мүчөдө иштетилди.Нормалдаштырылган окуу тереңдиги NOTCH2NL паралогдорунун биринчи экзондорунун өйдө жагындагы сезүү жана антисенс тилкелери боюнча эсептелген.Анормалдуу анти-сезим стенограммалары башталгычта же кайталануучу экспансия аймагынын ичинде отурган жабыр тарткан учурларда гана табылган (F1-14 жана F1-16-да Purple чокулары 3-сүрөттө).Мындан тышкары, 54 DEG аныкталып, бардыгы нейрондук функцияларга байланыштуу GO жана MPO терминдеринде байытылган.
Figure 3. таасир этпеген (жогоруда) жана таасир эткен (төмөндө) учурларда NOTCH2NLC биринчи экзонунун өйдө жагындагы нормалдаштырылган окуу тереңдиги.
Технология
Oxford Nanopore Technologies (ONT)
Nанопордук секвенирлөө башка секвенирлөө платформаларынан айырмаланат, муну менен нуклеотиддер ДНК синтез процессисиз түз окулат.Бир катар ДНК нано-өлчөмдүү белок тешикчеси (nanopore) аркылуу өткөн сайын, ар кандай нуклеотиддер кармалып, негиздер ырааттуулугуна өткөрүлүп берилиши мүмкүн болгон ар кандай иондук агымдарды жаратат.ONT секвенирлөө платформасынын өзү ДНКны окуунун узактыгына айкын техникалык чекти көрсөтпөйт.Ошондуктан, Ультра узун окуулар (ULRs) жогорку сапаттагы геномду чогултуу үчүн жеткиликтүү.Мындан тышкары, татаал ырааттуулуктун өзгөчөлүктөрүн же структуралык вариацияны кесип өтүүгө жетиштүү болгон бул өтө узун окуулар бул жерде кыска окуу ырааттуулугунун чектөөлөрүн жеңүүгө жардам берет.
Nanopore секвенирлөө
Түзүмдүн өзгөрүүсүн (SV) аныктоо
SСинтезсиз секвенирлөө негизинен калыпта ДНКнын метилденүү маалыматын сактап калган.Метилденген A, T, C жана G метилденбегендерден айырмаланган иондук агымдарды жаратат, аларды түздөн-түз платформадан окууга болот.Nanopore секвенциясы бир нуклеотиддик резолюцияда 5мC жана 6mA экөөнүн тең геномунун профилин түзүүгө мүмкүнчүлүк берет.
Шилтеме
Jun Sone, et.ал.Узак окуу ырааттуулугу нейрондук ядролук инклюзия оорусу менен байланышкан NOTCH2NLCдеги GGC кайталануучу кеңейүүлөрдү аныктайт.Жаратылыш генетикасы (2019)
Tech and Highlights ар кандай изилдөө ареналарында ар кандай жогорку өтүмдүү секвенирлөө технологияларын эң акыркы ийгиликтүү колдонууну, ошондой эле эксперименталдык дизайндагы жана маалыматтарды казып алуудагы эң сонун идеяларды бөлүшүүгө багытталган.
Билдирүү убактысы: 2022-жылдын 6-январына чейин