ТРАНСКРИПТОМИКА
жаратылыш
БАЙЛАНЫШТАР
Өнөкөт лимфоцитардык лейкоздогу SF3B1 мутациясынын толук узундуктагы транскрипт мүнөздөмөсү сакталып калган интрондордун төмөндөшүн көрсөтөт.
Толук узундуктагы транскрипттер|Nanopore sequencing|Альтернативдик изоформа анализи
Фон
SSF3B1 сплайсинг факторунун омматикалык мутациялары ар кандай рак оорулары менен, анын ичинде өнөкөт лимфоцитарлы лейкоз (CLL), увеалдык меланома, эмчек рагы ж.б. менен байланышы бар экени кеңири маалымдалган. Мындан тышкары, кыска мөөнөттөгү транскриптомиялык изилдөөлөр SF3B1 мутацияларынан келип чыккан аберранттык сплайсинг үлгүлөрүн көрсөттү.Бирок, бул альтернативдик сплайсинг үлгүлөрү боюнча изилдөөлөр көптөн бери окуянын деңгээлинде жана кыска окуу чогулган транскрипттердин чектелгендигинен изоформа деңгээлинде билимдин жоктугу менен чектелген.Бул жерде толук узундуктагы транскрипттерди түзүү үчүн нанопора секвенирлөө платформасы киргизилди, бул AS изоформаларын изилдөөгө мүмкүнчүлүк берди.
Эксперименталдык дизайн
Эксперименттер
Топтоо:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E мутация);3. Кадимки В-клеткалар
Тартиптештирүү стратегиясы:MinION 2D китепкана ырааттуулугу, PromethION 1D китепкана ырааттуулугу;ошол эле үлгүлөрдөн кыска окуу маалыматтар
Секвенирлөө платформасы:ONT MinION;ONT PromethION;
Биоинформатикалык анализ
Жыйынтыктар
А6 CLL үлгүсүнөн жана 3 В-клеткасынан жалпысынан 257 миллион окуу түзүлдү.Орто эсеп менен бул окуулардын 30,5% толук метраждуу стенограммалар катары аныкталган.
FРНКнын (FLAIR) узундуктагы альтернативдик изоформа анализи жогорку ишенимдүү изоформалардын топтомун түзүү үчүн иштелип чыккан.FLAIR төмөнкүчө чагылдырууга болот:
Nanopore окуйт тегиздөө: шилтеме геномунун негизинде жалпы транскрипт структурасын аныктоо;
Splice түйүнүнүн коррекциясы: аннотацияланган интрондордон, кыска окуу маалыматтарынан интрондордон же экөөнөн тең бириктирилген жер менен катар каталарды тууралоо (кызыл);
Collapse: бириктирүү чынжырларына негизделген өкүл изоформаларды жалпылоо (биринчи өтүү топтому).Колдоочу окуулардын санына жараша ишенимдүүлүгү жогору изофронду тандаңыз (Босого: 3).
Сүрөт 1. CLLдеги SF3B1 мутациясына байланыштуу толук узундуктагы изоформаларды аныктоо үчүн FLAIR анализи
FLAIR 326 699 жогорку ишенимдүүлүктөгү изоформаларды аныктады, алардын 90%ы жаңы изоформалар.Бул аннотацияланбаган изоформалардын көпчүлүгү белгилүү сплайс түйүндөрүнүн жаңы айкалышы (142,971), ал эми калган жаңы изоформаларда сакталган интрон (21,700) же жаңы экзон (3594) бар.
LОкуган ырааттуулугу мутантты SF3B1-K700E изоформа деңгээлинде өзгөртүлгөн сплайс участокторун аныктоого мүмкүнчүлүк берет.35 альтернативалуу 3'SS жана 10 альтернативдик 5'SS SF3B1-K700E жана SF3B1-WT ортосунда олуттуу түрдө айырмаланганы аныкталган.35 өзгөртүүнүн 33ү көптөн бери окуган тизмектер аркылуу жаңыдан ачылган.Nanopore маалыматтарында, SF3B1-K700E өзгөртүлгөн 3'SSs ортосундагы канондук сайттардын чокуларына чейинки аралыкты бөлүштүрүү -20 биттин тегерегинде, бул CLL кыска окуу ырааттуулугунда билдирилгендей, башкаруу бөлүштүрүүдөн олуттуу айырмаланат.ERGIC3 генинин изоформалары талдоого алынды, мында SF3B1-K700Eде проксималдык сплайсты камтыган жаңы изоформа көбүрөөк табылган.Проксималдык жана дисталдык 3'SS бир нече изоформаларды жаратуучу айырмаланган AS үлгүлөрү менен байланышкан.
Figure 2. nanopore секвенирлөө маалыматтары менен аныкталган альтернатива 3′ сплайсинг үлгүлөрү
IR окуяны колдонуу анализи IR идентификациясына жана сандык аныктоого болгон ишенимден улам кыска окууга негизделген талдоодо көптөн бери чектелген.SF3B1-K700E жана SF3B1-WTде IR изоформаларынын экспрессиясы нанопуралык ырааттуулуктун негизинде сандык аныкталды, бул SF3B1-K700Eдеги IR изоформаларынын глобалдык төмөндөөсүн ачып берди.
4-сүрөт. Айыл чарбасынын интенсивдүүлүгү жана үч айыл чарба системасы боюнча тармактык байланыш (А жана В);Кокус токой анализи (C) жана айыл чарба интенсивдүүлүгү менен AMF колонизациясынын ортосундагы байланыш (D)
Сүрөт 3. CLL SF3B1-K700Eде интронду ижарага алуу окуялары катуураак төмөндөтүлгөн
Технология
Nanopore Long-Read Sequencing
Nanopore секвенирование бир молекула реалдуу убакыт электр сигнал секвенирлөө технологиясы болуп саналат.
Dэки жипчелүү ДНК же РНК биоплёнкага камтылган нано тешиктүү протеин менен байланышып, мотор протеининин жетекчилиги астында ачылат.
DНА/РНК тилкелери чыңалуу айырмасынын таасири астында белгилүү бир ылдамдыкта нанопур каналынын белокунан өтөт.
Mолекулалар химиялык түзүлүшүнө жараша ар кандай электрдик сигналдарды жаратышат.
Rырааттуулугун бир убакытта аныктоого базалык чакыруу аркылуу жетишилет.
Толук узундуктагы транскриптомдук секвенирлөөнүн аткарылышы
√ Маалыматтын каныккандыгы
Салыштырылган маалымат каныккандыгына жетүү үчүн 7 эсе аз окуу керек.
√ Транскрипт структурасын идентификациялоо
Ар бир стенограмманын толук метраждуу окуусу менен ар түрдүү структуралык варианттарды аныктоо
√ Транскрипт деңгээлиндеги дифференциалдык анализ - Кыска окуу менен жашырылган өзгөрүүлөрдү ачыкка чыгаруу
Шилтеме
Танг AD, Soulette CM, Baren MJV, ж.б.Өнөкөт лимфоцитардык лейкоздо SF3B1 мутациясынын толук узундуктагы транскрипт мүнөздөмөсү сакталып калган интрондордун [J] төмөндөшүн көрсөтөт.Nature Communications.
Tech and Highlights ар кандай изилдөө ареналарында ар кандай жогорку өтүмдүү секвенирлөө технологияларын эң акыркы ийгиликтүү колдонууну, ошондой эле эксперименталдык дизайндагы жана маалыматтарды казып алуудагы эң сонун идеяларды бөлүшүүгө багытталган.
Посттун убактысы: Январь-08-2022