질병 퇴치에 Nanopore 긴 판독 재배열 적용

인간유전체학

자연 유전학

긴 판독 시퀀싱으로 신경 핵내 봉입 질환과 관련된 NOTCH2NLC의 GGC 반복 확장을 식별합니다.

하이라이트

1. 대규모 NIID 계열에 대한 연계 분석을 통해 두 개의 연결된 영역이 확인되었습니다.

2.ONT 기반 긴 판독 시퀀싱 및 Cas-9 매개 농축 ONT 시퀀싱을 통해 NOTCH2NLC의 5' UTR에서 NIID, GGC 반복 확장의 잠재적인 유전적 원인을 발견했습니다.이 연구는 분절 복제를 통해 진화한 인간 특정 유전자의 반복 확장을 처음으로 보고했습니다.

3.RNA 염기서열분석 결과 NOTCH2NLC의 GGC 반복 확장 영역의 시작 부분이나 내부에서 비정상적인 안티센스 전사체가 밝혀졌습니다.

배경

N유로날 핵내 봉입체 질환(NIID)은 중추 및 말초 신경계에 호산구성 유리질 핵내 봉입체의 존재를 특징으로 하는 진행성 및 치명적인 신경퇴행성 질환입니다.매우 다양한 임상 증상으로 인해 피부 생검이 도입될 때까지 진단에 큰 어려움을 겪습니다.그러나 조직병리학 기반 방법은 여전히 오진으로 어려움을 겪고 있어 NIID에 대한 유전적 이해가 필요합니다.

업적

연계분석

S짧은 읽기 시퀀싱 기반 전체 게놈 시퀀싱(WGS) 및 전체 엑솜 시퀀싱(WES)이 대규모 NIID 제품군(영향을 받은 구성원 13명 및 영향을 받지 않은 구성원 7명)에서 수행되었습니다.이 데이터에서 추출된 SNP에 대한 연계 분석에서는 1p36.31-p36.22(최대 LOD=2.32)의 3.5Mb 영역과 1p22.1-q21.3(최대 LOD: 4.21)의 58.1Mb 영역이라는 두 개의 연결된 영역만 나타났습니다. ).그러나 이들 연결된 영역에서는 병원성 SNP 또는 CNV가 확인되지 않았습니다.

NOTCH2NLC의 GGC 반복 확장

N아노포어 기반 시퀀싱은 8개 가족 중 영향을 받은 구성원 13명과 영향을 받지 않은 구성원 4명에서 처리되었습니다(영향을 받은 또 다른 구성원은 Pacbio 긴 읽기 시퀀싱 플랫폼으로 시퀀싱되었습니다).장시간 판독 데이터에 따르면 NOTCH2NLC 유전자 매핑의 5' UTR에서 58.1Mb 연결 영역에 대한 질병 관련 GGC 반복 확장이 나타났습니다(그림 1).이러한 반복 확장은 RP-PCR로 테스트한 산발적 NIID 사례 40개 모두에서도 확인되었습니다.

CNOTCH2NLC 반복(100 X-1,795 X)에서 더 높은 판독 범위를 달성하기 위해 나노포어 플랫폼에서 as-9 매개 표적 시퀀싱을 사용했습니다.이러한 합의 시퀀스는 GGC 반복 확장에 대한 이전 연구 결과와 잘 일치했습니다.더욱이, {(GGA)n(GGC)n}n 반복은 약점 지배적 표현형에 대한 잠재적인 유전적 마커로 확인되었습니다(그림 2).

그림 1. NOTCH2NLC 이소형의 엑손 1에서 확인된 질병 관련 반복 확장.

그림 2. 약점 지배적 표현형이 있거나 없는 NIID 환자에서 NPTCH2NLC 반복의 일치 시퀀스

NOTCH2NL 유전자는 인간 특이적 유전자로, 인간의 뇌 진화와 신경 질환에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다.그러나 99.1% 이상의 서열 동일성을 갖는 3개의 NOTCH2 관련 유전자(NOTCH2NLA, NOTCH2NLB 및 NOTCH2NLC)는 최신 인간 게놈 어셈블리까지 해결되지 않았습니다.나노포어 플랫폼에서 합성이 필요 없는 긴 판독 시퀀싱은 유사성이 높은 영역과 100% GC가 풍부한 (GGC)n 반복 영역을 해결하는 데 눈에 띄는 이점을 보여주었습니다.

NOTCH2NLC의 GGC 반복 확장

T랜스크립톰 시퀀싱은 영향을 받은 구성원 2명과 영향을 받지 않은 구성원 2명에서 처리되었습니다.정규화된 판독 깊이는 NOTCH2NL 파라로그의 첫 번째 엑손 상류에 있는 센스 및 안티센스 가닥에 대해 계산되었습니다.비정상적인 안티센스 전사체는 반복 확장 영역의 시작 부분이나 내부에 있는 영향을 받은 경우에서만 발견되었습니다(그림 3의 F1-14 및 F1-16의 보라색 피크).또한 54개의 DEG가 확인되었으며 모두 신경 기능과 관련된 GO 및 MPO 용어가 풍부했습니다.

그림 3. 영향을 받지 않은 경우(위) 및 영향을 받은 경우(아래)에서 NOTCH2NLC의 첫 번째 엑손의 업스트림에서 표준화된 읽기 깊이.

기술

ONT(옥스포드 나노포어 기술)

N아노포어 시퀀싱은 DNA 합성 과정 없이 뉴클레오티드를 직접 판독한다는 점에서 다른 시퀀싱 플랫폼과 차별화됩니다.단일 가닥 DNA가 나노 크기의 단백질 기공(나노기공)을 통과할 때, 서로 다른 뉴클레오티드는 서로 다른 이온 전류를 생성하며, 이는 포획되어 염기 서열로 전달될 수 있습니다.ONT 시퀀싱 플랫폼 자체는 DNA 판독 길이에 대한 명백한 기술적 한계를 나타내지 않습니다.따라서 고품질의 게놈 조립을 위해 Ultra-long Read(ULR)를 사용할 수 있습니다.더욱이, 복잡한 서열 특징이나 구조적 변이를 교차할 수 있을 만큼 긴 이러한 극도로 긴 판독은 여기서 짧은 판독 시퀀싱의 한계를 극복하는 데 도움이 됩니다.

나노포어 시퀀싱

구조 변형(SV) 식별

S합성 없는 시퀀싱은 템플릿의 DNA 메틸화 정보를 크게 보존했습니다.메틸화된 A, T, C 및 G는 플랫폼에서 직접 읽을 수 있는 메틸화되지 않은 이온 전류와 별개의 이온 전류를 생성합니다.Nanopore 시퀀싱은 단일 뉴클레오티드 분해능에서 5mC 및 6mA의 전체 게놈 프로파일링을 지원합니다.