코로나19 유전자 변이 식별에 Nanopore 기반 재배열 적용

전체 게놈 재배열

SARS-CoV-2의 유전체학 모니터링을 통해 I형 인터페론 반응을 조절하는 Nsp1 결실 변종 발견

Biomarker Technologies는 본 연구에서 샘플 서열 분석에 대한 기술 지원을 제공했습니다.

하이라이트

1. SARS-CoV-2 게놈 서열 분석 및 계통발생학적 분석을 통해 31개의 SNP와 4개의 Indel을 포함하여 35개의 재발성 돌연변이가 식별됩니다.

2. 117개 임상 표현형과의 연관성을 통해 잠재적인 가능성이 밝혀졌습니다.
중요한 돌연변이.

Nsp1 코딩 영역의 Δ500-532는 낮은 바이러스와 상관 관계가 있습니다
3.로드 및 혈청 IFN-β.

4. Δ500-532 돌연변이가 있는 바이러스 분리물은 더 낮은 IFN-I를 유도합니다.
감염된 세포의 반응.

실험적 설계

업적

1. 코로나19 역학 및 게놈 감시

임상 데이터는 2020년 1월 22일부터 2020년 2월 20일까지 발병 기간 동안 중국 쓰촨성에서 수집되었습니다. 쓰촨성에서 qPCR 테스트를 통해 총 538건의 코로나19 사례가 확인되었으며, 이 중 28.8%가 쓰촨성에서 발생했습니다. 수도.쓰촨성에서 확인된 사례는 기하급수적으로 증가하여 1월 30일에 정점에 달했습니다.또한 사회적 거리두기가 바이러스 확산을 예방하는 핵심 요소가 될 수 있다는 데이터가 뒷받침되었습니다.

그림 1. 중국 쓰촨성 코로나19 역학조사

2. SARS-CoV-2 게놈 구성 및 변종 식별

다중 PCR 증폭에 이어 나노포어 시퀀싱을 통해 248명의 환자로부터 총 310개의 거의 또는 부분적으로 완전한 게놈이 생성되었습니다.10개의 리드로 게놈의 80%를 커버합니다(평균 깊이: 샘플당 0.39M 리드).

그림 2. 쓰촨성 코호트의 각 변종 빈도

SARS-CoV-2 게놈에서 총 104개의 SNP와 18개의 Indel이 확인되었으며, 이중 31개의 SNP와 4개의 Indel이 재발성 유전 변이로 확인되었습니다.이를 우한의 169개 샘플 및 GISAID의 81,391개 고품질 공개 게놈 서열과 비교한 결과, 발견된 35개 변종 중 29개가 다른 대륙에서 나타났습니다.특히 Δ500-532, ACC18108AT, Δ729-737 및 T13243C를 포함한 4가지 변종은 쓰촨성과 우한에서만 발견되었으며 GISAID 데이터에는 없었습니다. 이는 이러한 변종이 우한에서 유입되었을 가능성이 매우 높음을 나타냅니다. 환자의 여행 기록.

최대 우도(ML) 방법과 베이지안 분자 시계 접근법을 사용한 진화 분석은 쓰촨성에서 발생한 88개의 새로운 바이러스와 기타 지역에서 선별된 250개의 게놈에 대해 처리되었습니다.Δ500-532(Nsp1 코딩 영역의 삭제)를 갖는 게놈이 계통수에 드물게 분포되어 있는 것으로 나타났습니다.Nsp1 변종에 대한 일배체형 분석을 통해 그 중 5개가 여러 도시에서 확인되었습니다.이러한 결과는 Δ500-532가 여러 도시에서 발생했으며 우한에서 여러 번 수입되었을 수 있음을 시사합니다.

그림 2. SARS-CoV-2 게놈의 재발성 유전 변이 및 계통발생 분석

3. 재발성 유전 변이와 임상적 의미의 연관성

117개의 임상 표현형이 코로나19 중증도와 관련이 있었고, 여기서 19개의 중증도 관련 표현형은 중증 및 중증이 아닌 특성으로 분류되었습니다.이러한 특성과 35개의 재발성 유전 변이 사이의 관계가 이중 클러스터 히트맵에 시각화되었습니다.GSEA와 유사한 순위 농축 분석에 따르면 Δ500-532는 ESR, 혈청 IFN-β 및 혈액 내 CD3+CD8+ T 세포 수와 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다.또한, qPCR 테스트에서는 Δ500-532를 보유하는 바이러스에 감염된 환자의 Ct 값이 가장 높았습니다. 즉, 바이러스 수치가 가장 낮았습니다.

그림 3. 35개의 재발성 유전 변이와 임상 표현형의 연관성

4. 바이러스 돌연변이 관련 임상 표현형에 대한 검증

Nsp1 기능에 대한 Δ500-532의 영향을 이해하기 위해 HEK239T 세포를 전장, WT Nsp1 및 결실이 있는 돌연변이 형태를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰습니다.처리된 각 HEK239T 세포의 전사체 프로파일은 PCA 분석을 위해 처리되었으며, 이는 결실 돌연변이가 상대적으로 더 가깝게 밀집되어 있으며 WT Nsp1과 유의하게 다르다는 것을 보여줍니다.돌연변이체에서 유의하게 상향조절된 유전자는 주로 "펩티드 생합성/대사 과정", "리보핵단백질 복합체 생합성", "막/ER에 대한 단백질 표적화" 등이 풍부했습니다. 또한 두 개의 결실은 WT와 뚜렷한 발현 패턴을 보여주었습니다.

그림 4. WT Nsp1에 의해 형질감염된 HEK239T 세포와 결실이 있는 세포에 대한 전사체 분석

IFN-1 반응에 대한 결실의 영향도 과발현 연구에서 테스트되었습니다.테스트된 모든 결실은 트랜스크립톰 수준과 단백질 수준 모두에서 형질감염된 HEK239T 및 A549 세포에서 IFN-1 반응을 감소시키는 것으로 나타났습니다.흥미롭게도, 결실에서 상당히 하향조절된 유전자는 "바이러스에 대한 방어 반응", "바이러스 게놈 복제", "RNA 폴리머라제 II에 의한 전사 조절" 및 "타입 I 인터페론에 대한 반응"에서 풍부해졌습니다.

그림 5. Δ500-532 돌연변이에서 인터페론 신호 전달 경로의 하향 조절

이 연구에서는 이러한 결실이 바이러스에 미치는 영향이 바이러스 감염 연구를 통해 추가로 확인되었습니다.특정 돌연변이가 있는 바이러스를 임상 샘플에서 분리하여 Calu-3 세포에 감염시켰습니다.바이러스 감염 연구에 대한 자세한 결과는 논문에서 읽을 수 있습니다.
도이:10.1016/j.chom.2021.01.015