전장 mRNA 시퀀싱 -PacBio

드 노보전장 전사체 시퀀싱(전사체 서열 분석이라고도 함)드 노보Iso-Seq은 읽기 길이 측면에서 PacBio 시퀀서의 장점을 활용하므로 중단 없이 전체 길이의 cDNA 분자를 시퀀싱할 수 있습니다.이는 전사체 조립 단계에서 생성된 오류를 완전히 방지하고 이소형 수준 분해능으로 고유 유전자 세트를 구성합니다.이 고유 유전자 세트는 전사체 수준에서 "참조 게놈"으로서 강력한 유전 정보를 제공합니다.또한 이 서비스는 차세대 염기서열분석 데이터와 결합하여 이소형 수준 발현의 정확한 정량화를 지원합니다.

플랫폼: PacBio 속편 II

라이브러리: SMRT 벨 라이브러리

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서비스 내용

데모 결과

사례 연구

서비스 장점

● 3'-말단에서 5'-말단까지 전체 길이의 cDNA 분자 직접 판독

● 시퀀스 구조의 Iso-form 레벨 분해능

● 정확성과 무결성이 높은 성적 증명서

● 다양한 종과의 호환성이 뛰어남

● PacBio Sequel II 시퀀싱 플랫폼 4개 탑재로 대용량 시퀀싱 능력 보유

● 700개 이상의 Pacbio 기반 RNA 염기서열 분석 프로젝트 경험이 풍부함

● BMKCloud 기반 결과 전달: 플랫폼에서 맞춤형 데이터 마이닝이 가능합니다.

● 애프터서비스는 프로젝트 완료 후 3개월 동안 유효합니다.

서비스 사양

플랫폼: PacBio 속편 II

시퀀싱 라이브러리: 폴리 A가 풍부한 mRNA 라이브러리

권장 데이터 수율: 20Gb/샘플(종에 따라 다름)

FLNC(%): ≥75%

*FLNC: 전체 길이의 비키메라 전사물

생물정보학 분석

● 원시 데이터 처리

● 성적증명서 식별

● 시퀀스 구조

● 발현량화

● 기능 주석

샘플 요구 사항 및 배송

샘플 요구사항:

뉴클레오티드:

농도(ng/μl)

양(μg)

청정

진실성

≥ 120

≥ 0.6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0.5-2.5

젤에 단백질이나 DNA 오염이 제한되거나 전혀 표시되지 않습니다.

식물의 경우: RIN≥7.5;

동물의 경우: RIN≥8.0;

5.0≥ 28S/18S≥1.0;

기준선 고도가 제한되거나 없음

조직: 무게(건조):≥1g
*5mg 미만의 조직의 경우, 급속 냉동(액체질소)된 조직 샘플을 보내는 것이 좋습니다.

세포 현탁액:세포수 = 3×10⁶- 1×10⁷
*냉동된 세포 용해물을 배송하는 것이 좋습니다.셀 개수가 5×10보다 작은 경우⁵, 액체질소에서 급속 냉동하는 것이 권장되며 이는 미세 추출에 바람직합니다.

혈액 샘플:용량≥1mL

미생물:질량 ≥ 1g

권장 샘플 배송

컨테이너:
2ml 원심분리 튜브(Tin Foil은 권장되지 않음)
샘플 라벨링: 그룹+복제(예: A1, A2, A3);B1, B2, B3... ...

선적:

1. 드라이아이스: 샘플을 가방에 포장하고 드라이아이스에 묻어야 합니다.
2. RNAstable 튜브: RNA 샘플은 RNA 안정화 튜브(예: RNAstable®)에서 건조되고 실온에서 배송될 수 있습니다.

서비스 작업 흐름

실험 설계

샘플 배송

RNA 추출

도서관 건립

시퀀싱

데이터 분석

판매 후 서비스

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1.FLNC 길이 분포

FLNC(Full-length Non-chimeric Read)의 길이는 라이브러리 구성에서 cDNA의 길이를 나타냅니다.FLNC 길이 분포는 라이브러리 구성의 품질을 평가하는 데 중요한 지표입니다.

mRNA-FLNC-읽기 길이 분포

FLNC 읽기 길이 분포

2.완전한 ORF 영역 길이 분포

우리는 TransDecoder를 사용하여 단백질 코딩 영역과 해당 아미노산 서열을 예측하여 모든 샘플에 완전한 중복되지 않은 전사 정보가 포함된 고유 유전자 세트를 생성합니다.

mRNA-완전-ORF-길이-분포

완전한 ORF 영역 길이 분포

3.KEGG 경로 강화 분석

차별적으로 발현된 전사체(DET)는 PacBio 시퀀싱 데이터로 생성된 전체 길이 전사체 세트에 NGS 기반 RNA 시퀀싱 데이터를 정렬하여 식별할 수 있습니다.이러한 DET는 다양한 기능 분석(예: KEGG 경로 강화 분석)을 위해 추가로 처리될 수 있습니다.

mRNA-DEG-KEGG-경로 강화

DET KEGG 경로 강화 - 점 도표

BMK 케이스

Populus 줄기 전사체의 발달 역학

게시된 날짜: 식물 생명공학 저널, 2019

시퀀싱 전략:
샘플 수집:줄기 영역: Nanlin895의 정점, 첫 번째 절점(IN1), 두 번째 절점(IN2), 세 번째 절점(IN3), 절간(IN4) 및 절간(IN5)
NGS 서열:15명의 개인의 RNA를 하나의 생물학적 샘플로 모았습니다.NGS 서열을 위해 각 지점의 세 가지 생물학적 복제물이 처리되었습니다.
TGS 시퀀스:줄기 영역은 정점, IN1-IN3 및 IN4-IN5의 세 영역으로 나누어졌습니다.각 영역은 0-1kb, 1-2kb, 2-3kb 및 3-10kb의 네 가지 유형의 라이브러리를 사용하여 PacBio 시퀀싱을 위해 처리되었습니다.

주요 결과

1. 총 87,150개의 전체 길이 전사체가 확인되었으며, 그중 2,081개의 새로운 이소형과 62,058개의 새로운 대체 접합 이소형이 확인되었습니다.
2.1187개의 lncRNA와 356개의 융합 유전자가 확인되었습니다.
3. 1차 성장부터 2차 성장까지, 995개의 차별적으로 발현된 유전자로부터 15838개의 차별적으로 발현된 전사체가 확인되었습니다.모든 DEG에서 1216개는 전사 인자였으며 대부분은 아직 보고되지 않았습니다.
4.GO 농축 분석을 통해 1차 및 2차 성장에서 세포 분열과 산화-환원 과정의 중요성이 밝혀졌습니다.