ТРАНСКРИПТОМИКА
табиғат
БАЙЛАНЫСТАР
Созылмалы лимфоцитарлық лейкоздағы SF3B1 мутациясының толық ұзындықтағы транскрипттік сипаттамасы сақталған интрондардың төмендеуін көрсетеді.
Толық метражды транскрипттер|Nanopore секвенирлеу|Альтернативті изоформалық талдау
Фон
SSF3B1 сплайсинг факторындағы омматикалық мутациялар созылмалы лимфоцитарлы лейкоз (CLL), увеальды меланома, сүт безі обыры және т.б. қоса, әртүрлі қатерлі ісіктермен байланысты екендігі туралы кеңінен хабарланды. Сонымен қатар, қысқа оқылған транскриптомиялық зерттеулер SF3B1 мутацияларынан туындаған аберрантты сплайсинг үлгілерін анықтады.Дегенмен, осы альтернативті сплайсинг үлгілері бойынша зерттеулер ұзақ уақыт бойы оқиға деңгейінде және қысқа оқылатын жинақталған транскрипттердің шектелуіне байланысты изоформа деңгейінде білімнің болмауымен шектелді.Мұнда толық ұзындықтағы транскрипттерді жасау үшін нанопора секвенирлеу платформасы енгізілді, ол AS изоформаларында зерттеу жүргізуге мүмкіндік берді.
Эксперименттік дизайн
Эксперименттер
Топтастыру:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E мутация);3. Қалыпты В-жасушалар
Тізбектеу стратегиясы:MinION 2D кітапхана реттілігі, PromethION 1D кітапхана секвенциясы;бірдей үлгілерден алынған қысқаша оқылатын деректер
Тізбектеу платформасы:ONT MinION;ONT PromethION;
Биоинформатикалық талдау
Нәтижелер
А6 CLL үлгілері мен 3 B-жасушаларынан барлығы 257 миллион оқу жасалды.Осы оқылғандардың орта есеппен 30,5%-ы толық метражды транскрипттер ретінде анықталды.
FРНҚ-ның (FLAIR) үлкен ұзындықтағы альтернативті изоформалық талдауы жоғары сенімді изоформалар жинағын құру үшін әзірленді.FLAIR келесідей қорытындылауға болады:
Nanopore оқиды туралау: анықтамалық геномға негізделген жалпы транскрипт құрылымын анықтау;
Sплице түйісуін түзету: аннотацияланған интрондардың, қысқа оқылатын деректердің интрондарының немесе екеуінің қосылыс орны бар реттілік қателерін түзетіңіз (қызыл);
Collapse: қосылыс тізбегіне негізделген репрезентативті изоформаларды қорытындылау (алғашқы өту жиынтығы).Қолдау көрсететін оқулар санына негізделген жоғары сенімді изотопты таңдаңыз (Шегі: 3).
Сурет 1. CLL-дегі SF3B1 мутациясымен байланысты толық ленталық изоформаларды анықтау үшін FLAIR талдауы
FLAIR 326 699 жоғары сенімді қосылатын изоформаларды анықтады, олардың 90%-ы жаңа изоформалар.Бұл аннотацияланбаған изоформалардың көпшілігі белгілі қосылыстардың (142,971) жаңа комбинациялары болып табылды, ал қалған жаңа изоформаларда сақталған интрон (21,700) немесе жаңа экзон (3594) бар.
Lұзақ оқылатын тізбектер изоформа деңгейінде мутантты SF3B1-K700E өзгертілген қосылыс орындарын анықтауға мүмкіндік береді.35 балама 3'SS және 10 баламалы 5'SS SF3B1-K700E және SF3B1-WT арасында айтарлықтай дифференциалды түрде бөлінгені анықталды.35 өзгерістің 33-і ұзақ оқылған тізбектер арқылы жаңадан ашылды.Nanopore деректерінде SF3B1-K700E өзгертілген 3'SS арасындағы қашықтықтың канондық нүктелердің шыңдарына дейін таралуы шамамен -20 бит құрайды, бұл CLL қысқа оқу реттіліктерінде хабарланғанға ұқсас бақылау таралуынан айтарлықтай ерекшеленеді.ERGIC3 генінің изоформалары талданды, мұнда SF3B1-K700E-де проксимальды қосылыс орны бар жаңа изоформа көбірек табылды.Проксимальды және дистальды 3'SS бірнеше изоформаларды тудыратын ерекше AS үлгілерімен байланысты болды.
Сурет 2. Нанопораларды реттілік деректерімен анықталған балама 3′ сплайсинг үлгілері
IR оқиғасын пайдалану талдауы IR сәйкестендіру мен сандық анықтауға сенімділік себебінен қысқа оқуға негізделген талдауда ұзақ уақыт шектелген.SF3B1-K700E және SF3B1-WT-де ИҚ изоформаларының экспрессиясы нанокеру тізбегі негізінде сандық түрде анықталды, бұл SF3B1-K700E ИК изоформаларының жаһандық төмендеу реттелуін көрсетті.
Сурет 4. Ауыл шаруашылығының қарқындылығы және үш ауыл шаруашылығы жүйесі (A және B) бойынша желілік байланыс;Кездейсоқ орман талдауы (C) және ауылшаруашылық қарқындылығы мен AMF колонизациясының арасындағы байланыс (D)
Сурет 3. Intron жалдау оқиғалары CLL SF3B1-K700E жүйесінде күштірек төмендетілген
Технология
Nanopore Long-Read Sequencing
Nанопорлық секвенирлеу – нақты уақыт режиміндегі бір молекулалы электрлік сигналды реттілік технологиясы.
Dқос тізбекті ДНҚ немесе РНҚ биопленкаға енгізілген нанокеуекті протеинмен байланысады және қозғалтқыш ақуызының жетекшілігімен ашылады.
DNA/РНҚ жіптері кернеу айырмашылығының әсерінен белгілі бір жылдамдықпен нанокеру арнасының ақуызы арқылы өтеді.
MОлекулалар химиялық құрылымына сәйкес әртүрлі электрлік сигналдарды жасайды.
Rтізбектерді бір уақытта анықтау негізгі шақыру арқылы жүзеге асырылады.
Толық ұзындықтағы транскриптомды секвенирлеуді орындау
√ Деректердің қанықтылығы
Салыстырмалы деректер қанықтылығына жету үшін 7 есе аз оқу қажет.
√ Транскрипт құрылымын сәйкестендіру
Әр транскрипттің толық мәтінін консенсуспен оқу арқылы әртүрлі құрылымдық нұсқаларды анықтау
√ Транскрипт деңгейіндегі дифференциалды талдау - қысқаша оқу арқылы жасырылған өзгерістерді ашыңыз
Анықтама
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV және т.б.Созылмалы лимфоцитарлы лейкоздағы SF3B1 мутациясының толық ұзындықтағы транскрипттік сипаттамасы сақталған интрондардың [J] төмендеуін көрсетеді.Табиғат коммуникациялары.
Tech and Highlights әртүрлі зерттеулер аренасында әр түрлі жоғары өнімді секвенирлеу технологияларының ең соңғы сәтті қолданылуын, сондай-ақ тәжірибелік дизайн мен деректерді өндірудегі тамаша идеялармен бөлісуді мақсат етеді.
Жіберу уақыты: 08 қаңтар 2022 ж