Толық ұзындықтағы мРНҚ секвенирлеу - PacBio
Қызметтің артықшылықтары
● Толық ұзындықтағы cDNA молекуласын 3'- ұшынан 5'- соңына дейін тікелей оқу
● реттілік құрылымындағы изо-форма деңгейінің ажыратымдылығы
● Жоғары дәлдік пен тұтастықтағы транскрипттер
● vaiour түрлерімен жоғары үйлесімді
● 4 PacBio Sequel II секвенирлеу платформаларымен жабдықталған үлкен реттілік сыйымдылығы
● 700-ден астам Pacbio негізіндегі РНҚ секвенирлеу жобаларында жоғары тәжірибе
● BMKCloud негізіндегі нәтижені жеткізу: платформада қол жетімді теңшелген деректерді іздеу.
● Сатудан кейінгі қызметтер жоба аяқталғаннан кейін 3 айға жарамды
Қызмет сипаттамалары
Платформа: PacBio Sequel II
Тізбектеу кітапханасы: Poly A- байытылған мРНҚ кітапханасы
Ұсынылатын деректер өнімділігі: 20 Гб/үлгі (түрлерге байланысты)
FLNC（%）: ≥75%
*FLNC: толық ұзындықты химерикалық емес транскрипттер
Биоинформатикалық талдаулар
● Шикі деректерді өңдеу
● Транскриптті сәйкестендіру
● Тізбек құрылымы
● Өрнекті сандық анықтау
● Функция түсіндірмесі
Үлгіге қойылатын талаптар және жеткізу
Үлгіге қойылатын талаптар:
Нуклеотидтер:
| Конс.(нг/мкл) | Мөлшері (мкг) | Тазалық | Тұтастық |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Гельде ақуыз немесе ДНҚ ластануы шектеулі немесе жоқ. | Өсімдіктер үшін: RIN≥7,5; Жануарлар үшін: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; шектелген немесе жоқ бастапқы биіктік |
Тін: Салмағы (құрғақ):≥1 г
*5 мг-ден аз тіндер үшін флэш мұздатылған (сұйық азотта) тін үлгісін жіберуді ұсынамыз.
Жасуша суспензиясы:Ұяшықтар саны = 3×106- 1×107
*Мұздатылған жасуша лизатын жөнелтуді ұсынамыз.Бұл ұяшық 5×10-нан аз болған жағдайда5, сұйық азотта мұздатылған жарқыл ұсынылады, бұл микро экстракция үшін қолайлы.
Қан үлгілері:Көлемі≥1 мл
Микроорганизм:Массасы ≥ 1 г
Ұсынылатын үлгіні жеткізу
Контейнер:
2 мл центрифуга түтігі (қаңылтыр фольга ұсынылмайды)
Үлгі таңбалау: Топ+қайталау, мысалы, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
жөнелту:
1. Құрғақ мұз: үлгілерді қаптарға салып, құрғақ мұзға көму керек.
2. РНҚ тұрақты түтіктер: РНҚ үлгілерін РНҚ тұрақтандыру түтігінде (мысалы, RNAstable®) кептіруге және бөлме температурасында жөнелтуге болады.
Қызметтің жұмыс ағыны
Эксперимент дизайны
Үлгіні жеткізу
РНҚ экстракциясы
Кітапхана құрылысы
Тізбектеу
Деректерді талдау
Сатудан кейінгі қызметтер
1.FLNC ұзындығын бөлу
Толық ұзындықтағы химерикалық емес оқу ұзақтығы (FLNC) кітапхана құрылысындағы cDNA ұзындығын көрсетеді.FLNC ұзындығын бөлу кітапхана құрылысының сапасын бағалаудағы шешуші көрсеткіш болып табылады.
FLNC оқу ұзақтығын бөлу
2. ORF аймағының ұзындығын толық бөлу
Біз TransDecoder-ті ақуызды кодтау аймақтарын және барлық үлгілерде толық артық емес транскрипт ақпаратын қамтитын униген жиындарын құру үшін сәйкес аминқышқылдарының ретін болжау үшін пайдаланамыз.
ORF аймағының ұзындығын толық бөлу
3.KEGG жолын байыту талдауы
Дифференциалды түрде көрсетілген транскрипттерді (DETs) PacBio секвенирлеу деректері арқылы жасалған толық ұзындықтағы транскрипт жиындарында NGS негізіндегі РНҚ секвенирлеу деректерін туралау арқылы анықтауға болады.Бұл DET әр түрлі функционалдық талдау үшін өңделуі мүмкін, мысалы, KEGG жолын байыту талдауы.
DET KEGG жолын байыту -Нүкте сызбасы
BMK ісі
Populus дің транскриптомының даму динамикасы
Жарияланды: Өсімдік биотехнологиясы журналы, 2019 ж
Тізбектеу стратегиясы:
Үлгі жинағы:дің аймақтары: шың, бірінші түйін аралық(IN1), екінші түйін аралық(IN2), үшінші түйін аралық(IN3), аралық(IN4) және Nanlin895 аралық(IN5)
NGS-тізбегі:15 адамның РНҚ бір биологиялық үлгі ретінде біріктірілді.Әр нүктенің үш биологиялық көшірмелері NGS тізбегі үшін өңделді
TGS реттілігі:Сабақ аймақтары үш аймаққа бөлінді, яғни шың, IN1-IN3 және IN4-IN5.Әрбір аймақ кітапханалардың төрт түрімен PacBio реттілігі үшін өңделді: 0-1 кб, 1-2 кб, 2-3 кб және 3-10 кб.
Негізгі нәтижелер
1. Барлығы 87150 толық метражды транскрипт анықталды, оларда 2081 жаңа изоформа және 62058 жаңа альтернативті сплайс изоформасы анықталды.
2,1187 lncRNA және 356 синтез гендері анықталды.
3. Біріншілік өсімнен екіншілік өсімге дейін 995 дифференциалды экспрессияланған гендердің 15838 дифференциалды транскрипциясы анықталды.Барлық DEG-де 1216 транскрипция факторлары болды, олардың көпшілігі әлі хабарланбаған.
4.GO байыту талдауы біріншілік және екіншілік өсудегі жасушаның бөлінуі мен тотығу-тотықсыздану процесінің маңыздылығын анықтады.
Баламалы сплайсинг оқиғалары және әртүрлі изоформалар
Транскрипция факторлары бойынша WGCNA талдауы
Анықтама
Чао К, Гао ЗФ, Чжан Д, т.б.Populus дің транскриптомының даму динамикасы.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi: 10.1111/pbi.12958
