ადამიანის გენომიკა
ბუნების გენეტიკა
დიდხანს წაკითხული თანმიმდევრობა განსაზღვრავს GGC განმეორებით გაფართოებებს NOTCH2NLC-ში, რომლებიც დაკავშირებულია ნეირონულ ინტრაბირთვულ ინკლუზიურ დაავადებასთან
ONT resequencing |ილუმინა |მთელი ეგზომის თანმიმდევრობა |CRISPR-Cas9 ONT მიზნობრივი თანმიმდევრობა |RNA-seq |ONT 5mC მეთილაციის გამოძახება
მაჩვენებლები
1. NIID-ის დიდ ოჯახზე კავშირის ანალიზით გამოვლინდა ორი დაკავშირებული რეგიონი.
2.ONT-ზე დაფუძნებული ხანგრძლივი წაკითხული თანმიმდევრობა და Cas-9 შუამავლობით გამდიდრება ONT თანმიმდევრობა აღმოაჩინეს NIID, GGC განმეორებითი გაფართოების პოტენციური გენეტიკური მიზეზი NOTCH2NLC-ის 5′ UTR-ში.ამ კვლევამ პირველად მოიხსენია ადამიანის სპეციფიკურ გენებში განმეორებითი გაფართოება, რომელიც განვითარდა სეგმენტური დუბლირების გზით.
3.რნმ-ის თანმიმდევრობამ გამოავლინა არანორმალური ანტისენსიური ტრანსკრიპტები GGC განმეორებითი გაფართოების რეგიონებში NOTCH2NLC-ში.
ფონი
Nევრონული ინტრანუკლეარული ინკლუზიური დაავადება (NIID) არის პროგრესირებადი და ფატალური ნეიროდეგენერაციული დაავადება, რომელიც ხასიათდება ეოზინოფილური ჰიალინის ინტრანუკლეარული ჩანართებით ცენტრალურ და პერიფერიულ ნერვულ სისტემებში.მისი ძალიან ცვალებადი კლინიკური გამოვლინებები იწვევს დიაგნოსტიკის დიდ სირთულეებს კანის ბიოფსიის დანერგვამდე.თუმცა, ჰისტოპათოლოგიაზე დაფუძნებული მეთოდები კვლავ იტანჯება არასწორი დიაგნოზით, რაც მოითხოვს NIID-ის გენეტიკურ გაგებას.
მიღწევები
კავშირის ანალიზი
Sჰორტ-კითხვის თანმიმდევრობაზე დაფუძნებული მთლიანი გენომის თანმიმდევრობა (WGS) და მთლიანი ეგზომის თანმიმდევრობა (WES) ჩატარდა NIID-ის დიდ ოჯახზე (13 დაზარალებული და 7 დაუცველი წევრი).ამ მონაცემებიდან ამოღებულ SNP-ებზე კავშირის ანალიზმა გამოავლინა მხოლოდ ორი დაკავშირებული რეგიონი: 3.5 მბ რეგიონი 1p36.31-p36.22 (მაქსიმალური LOD=2.32) და 58.1 მბ რეგიონი 1p22.1-q21.3 (მაქსიმალური LOD: 4.21). ).თუმცა, არ იყო გამოვლენილი პათოგენური SNP ან CNV ამ დაკავშირებულ რეგიონებში.
GGC განმეორებითი გაფართოებები NOTCH2NLC-ში
Nანოპორზე დაფუძნებული თანმიმდევრობა დამუშავდა 13 დაზარალებულ და 4 ზემოქმედების ქვეშ მყოფ წევრზე 8 ოჯახიდან (კიდევ ერთი დაზარალებული წევრი დახარისხდა Pacbio-ს ხანგრძლივი წაკითხვის თანმიმდევრობის პლატფორმით.).დიდხანს წაკითხულმა მონაცემებმა გამოავლინა დაავადებასთან დაკავშირებული GGC განმეორებითი გაფართოება NOTCH2NLC გენის 5' UTR-ში, რომელიც ასახავს 58.1 Mb დაკავშირებულ რეგიონს (სურათი 1).ეს განმეორებითი გაფართოება ასევე იდენტიფიცირებული იყო RP-PCR-ით ტესტირებულ 40 სპორადულ NIID შემთხვევაში.
Cროგორც-9 შუამავლობით სამიზნე თანმიმდევრობა ნანოპურ პლატფორმაზე იყო გამოყენებული NOTCH2NLC გამეორებაზე უფრო მაღალი წაკითხვის დაფარვის მისაღწევად (100 X-1,795 X).ეს კონსენსუსის თანმიმდევრობები კარგად ეთანხმება წინა აღმოჩენებს GGC განმეორებითი გაფართოებების შესახებ.უფრო მეტიც, {(GGA)n (GGC)n}n გამეორება იყო იდენტიფიცირებული, როგორც პოტენციური გენეტიკური მარკერი სისუსტის დომინანტური ფენოტიპისთვის (სურათი 2).
სურათი 1. დაავადებასთან დაკავშირებული განმეორებითი გაფართოება იდენტიფიცირებულია NOTCH2NLC იზოფორმების ეგზონ 1-ზე.
სურათი 2. NPTCH2NLC-ის კონსენსუსური თანმიმდევრობები მეორდება NIID პაციენტებში (*) ან სისუსტის დომინანტური ფენოტიპის გარეშე
NOTCH2NL გენები არის ადამიანის სპეციფიკური გენები, რომლებიც, სავარაუდოდ, მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ ადამიანის ტვინის ევოლუციასა და ნევროლოგიურ დაავადებებში.თუმცა, სამი NOTCH2 დაკავშირებული გენი (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB და NOTCH2NLC) >99.1% თანმიმდევრობის იდენტურობით არ იყო გადაწყვეტილი ადამიანის გენომის უახლეს შეკრებამდე.სინთეზის გარეშე და დიდი ხნის წაკითხული თანმიმდევრობა ნანოპურ პლატფორმაზე აჩვენა შესამჩნევი უპირატესობები მაღალი მსგავსების და (GGC)n გამეორებების რეგიონების გადაჭრაში 100% GC-ით მდიდარი.
GGC განმეორებითი გაფართოებები NOTCH2NLC-ში
Tრანკრიპტომის თანმიმდევრობა დამუშავდა 2 დაზარალებულ და 2 არაეფექტურ წევრზე.ნორმალიზებული წაკითხვის სიღრმე გამოითვლებოდა გრძნობათა და ანტისენსიურ ძაფებზე NOTCH2NL პარალოგების პირველი ეგზონების ზემოთ.არანორმალური ანტისენსიური ტრანსკრიპტები ნაპოვნი იქნა მხოლოდ დაზარალებულ შემთხვევებში, რომლებიც დგანან დასაწყისში ან განმეორებითი გაფართოების რეგიონში (იისფერი მწვერვალები F1-14-ში და F1-16 სურათზე 3.).გარდა ამისა, იდენტიფიცირებული იყო 54 DEG და ყველა გამდიდრდა GO და MPO ტერმინებით, რომლებიც დაკავშირებულია ნეირონულ ფუნქციებთან.
ნახაზი 3. ნორმალიზებული წაკითხვის სიღრმე NOTCH2NLC-ის პირველი ეგზონის ზემოთ ზემოქმედების ქვეშ (ზემოთ) და დაზარალებულ (ქვემოთ) შემთხვევებში.
ტექნიკა
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nანოპორული თანმიმდევრობა განასხვავებს თავს სხვა სეკვევენირების პლატფორმებისგან, რომ ნუკლეოტიდები იკითხება უშუალოდ დნმ-ის სინთეზის პროცესის გარეშე.როდესაც ერთი ჯაჭვის დნმ გადის ნანო ზომის ცილის ფორაში (ნანოფორა), სხვადასხვა ნუკლეოტიდები წარმოქმნიან სხვადასხვა იონურ დინებას, რომელიც შეიძლება დაიჭიროს და გადავიდეს ბაზების თანმიმდევრობაში.ONT თანმიმდევრობის პლატფორმა არ აჩვენებს აშკარა ტექნიკურ შეზღუდვას დნმ-ის წაკითხვის ხანგრძლივობაზე.ამიტომ, ულტრა გრძელი წაკითხვები (ULRs) ხელმისაწვდომია გენომის მაღალი ხარისხის შეკრებისთვის.უფრო მეტიც, ეს ძალიან გრძელი წაკითხვები, რომლებიც საკმარისად გრძელია რთული თანმიმდევრობის მახასიათებლების ან სტრუქტურული ვარიაციების გადაკვეთისთვის, ხელს უწყობს აქ მოკლე წაკითხვის თანმიმდევრობის შეზღუდვების დაძლევას.
ნანოფორების თანმიმდევრობა
სტრუქტურის ვარიაციის (SV) იდენტიფიკაცია
Sსინთეზის გარეშე თანმიმდევრობა დიდწილად ინახავს დნმ-ის მეთილაციის ინფორმაციას შაბლონზე.მეთილირებული A, T, C და G წარმოქმნის განსხვავებულ იონურ დენებს არამეთილირებული დენებისაგან, რომელთა წაკითხვა შესაძლებელია პირდაპირ პლატფორმაზე.ნანოპორების თანმიმდევრობა აძლიერებს მთლიანი გენომის პროფილირებას 5mC და 6mA ერთ ნუკლეოტიდის რეზოლუციით.
მითითება
ჯუნ სონე და ა.ალ.დიდხანს წაკითხული თანმიმდევრობა განსაზღვრავს GGC განმეორებით გაფართოებას NOTCH2NLC-ში, რომელიც დაკავშირებულია ნეირონულ ინტრაბირთვულ ინკლუზიურ დაავადებასთან.ბუნების გენეტიკა (2019)
ტექნიკური და მაჩვენებლები მიზნად ისახავს სხვადასხვა მაღალი გამტარუნარიანობის თანმიმდევრობის ტექნოლოგიების უახლესი წარმატებული გამოყენების გაზიარებას სხვადასხვა კვლევის ასპარეზზე, ასევე ბრწყინვალე იდეების ექსპერიმენტულ დიზაინსა და მონაცემთა მოპოვებაში.
გამოქვეყნების დრო: იან-06-2022