სრულმეტრაჟიანი mRNA თანმიმდევრობა - PacBio
სერვისის უპირატესობები
● სრული სიგრძის cDNA მოლეკულის პირდაპირი წაკითხვა 3'- ბოლოდან 5'- ბოლომდე
● იზო-ფორმის დონის გარჩევადობა მიმდევრობის სტრუქტურაში
● ტრანსკრიპტები მაღალი სიზუსტით და მთლიანობით
● უაღრესად თავსებადია ვაიურ სახეობებთან
● თანმიმდევრობის დიდი სიმძლავრე აღჭურვილი PacBio Sequel II თანმიმდევრობის 4 პლატფორმით
● მაღალი გამოცდილება Pacbio-ზე დაფუძნებული რნმ-ის 700-ზე მეტ პროექტში
● BMKCloud-ზე დაფუძნებული შედეგების მიწოდება: მორგებული მონაცემთა მოპოვება ხელმისაწვდომია პლატფორმაზე.
● გაყიდვის შემდგომი მომსახურება მოქმედებს 3 თვის განმავლობაში პროექტის დასრულებიდან
სერვისის სპეციფიკაციები
პლატფორმა: PacBio Sequel II
თანმიმდევრობის ბიბლიოთეკა: პოლი A- გამდიდრებული mRNA ბიბლიოთეკა
მონაცემთა რეკომენდებული გამოსავალი: 20 გბ/ნიმუში (დამოკიდებულია სახეობაზე)
FLNC (%): ≥75%
*FLNC: სრულმეტრაჟიანი არაქიმერული ტრანსციპტები
ბიოინფორმატიკის ანალიზები
● ნედლი მონაცემთა დამუშავება
● ტრანსკრიპტის იდენტიფიკაცია
● მიმდევრობის სტრუქტურა
● გამოხატვის რაოდენობრივი განსაზღვრა
● ფუნქციის ანოტაცია
ნიმუშის მოთხოვნები და მიწოდება
ნიმუშის მოთხოვნები:
ნუკლეოტიდები:
| კონს.(ნგ/მკლ) | რაოდენობა (მკგ) | სიწმინდე | მთლიანობა |
| ≥ 120 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 გელზე ნაჩვენებია შეზღუდული ცილის ან დნმ-ის დაბინძურება ან არა. | მცენარეებისთვის: RIN≥7.5; ცხოველებისთვის: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; შეზღუდული ან არ არის საბაზისო სიმაღლე |
ქსოვილი: წონა (მშრალი):≥1 გ
*5 მგ-ზე ნაკლები ქსოვილისთვის, ჩვენ გირჩევთ გააგზავნოთ გაყინული (თხევადი აზოტით) ქსოვილის ნიმუში.
უჯრედის სუსპენზია:უჯრედების რაოდენობა = 3×106- 1×107
*ჩვენ გირჩევთ გაგზავნოთ გაყინული უჯრედის ლიზატი.თუ ეს უჯრედი ითვლის 5×10-ზე ნაკლები5რეკომენდირებულია თხევად აზოტში ფლეში გაყინული, რაც სასურველია მიკრო ექსტრაქციისთვის.
სისხლის ნიმუშები:მოცულობა≥1 მლ
მიკროორგანიზმი:მასა ≥ 1 გ
რეკომენდებული ნიმუშის მიწოდება
კონტეინერი:
2 მლ ცენტრიფუგის მილაკი (თუნუქის ფოლგა არ არის რეკომენდებული)
ნიმუშის მარკირება: ჯგუფი+რეპლიკა, მაგ. A1, A2, A3;B1, B2, B3 ... ...
გადაზიდვა:
1. მშრალი ყინული: ნიმუშები უნდა იყოს შეფუთული ჩანთებში და დამარხული მშრალ ყინულში.
2. რნმ სტაბილური მილები: რნმ-ის ნიმუშები შეიძლება გაშრეს რნმ-ის სტაბილიზაციის მილში (მაგ. RNAstable®) და გაიგზავნოს ოთახის ტემპერატურაზე.
სერვისის სამუშაო ნაკადი
ექსპერიმენტის დიზაინი
ნიმუშის მიწოდება
რნმ-ის ექსტრაქცია
ბიბლიოთეკის მშენებლობა
თანმიმდევრობა
Მონაცემთა ანალიზი
გაყიდვის შემდგომი მომსახურება
1.FLNC სიგრძის განაწილება
სრულმეტრაჟიანი არაქიმერული წაკითხვის სიგრძე (FLNC) მიუთითებს cDNA-ს სიგრძეზე ბიბლიოთეკის მშენებლობაში.FLNC სიგრძის განაწილება გადამწყვეტი მაჩვენებელია ბიბლიოთეკის მშენებლობის ხარისხის შესაფასებლად.
FLNC წაკითხვის სიგრძის განაწილება
2. სრული ORF რეგიონის სიგრძის განაწილება
ჩვენ ვიყენებთ ტრანსდეკოდერს პროტეინის კოდირების რეგიონებისა და შესაბამისი ამინომჟავების თანმიმდევრობების პროგნოზირებისთვის უნიგენური ნაკრების შესაქმნელად, რომელიც შეიცავს სრულ, არაზედმეტ ტრანსკრიპტის ინფორმაციას ყველა ნიმუშში.
სრული ORF რეგიონის სიგრძის განაწილება
3.KEGG ბილიკის გამდიდრების ანალიზი
დიფერენციალურად გამოხატული ტრანსკრიპტების (DETs) იდენტიფიცირება შესაძლებელია NGS-ზე დაფუძნებული რნმ-ის თანმიმდევრობის მონაცემების გასწორებით PacBio თანმიმდევრობის მონაცემებით გენერირებული სრულმეტრაჟიანი ტრანსკრიპტების ნაკრებებზე.ეს DET-ები შეიძლება შემდგომ დამუშავდეს სხვადასხვა ფუნქციური ანალიზისთვის, მაგ. KEGG ბილიკის გამდიდრების ანალიზისთვის.
DET KEGG ბილიკის გამდიდრება - წერტილოვანი ნაკვეთი
BMK საქმე
Populus ფუძის ტრანსკრიპტომის განვითარების დინამიკა
გამოქვეყნებულია: მცენარეთა ბიოტექნოლოგიის ჟურნალი, 2019 წელი
თანმიმდევრობის სტრატეგია:
ნიმუშების კოლექცია:ღეროვანი რეგიონები: მწვერვალი, პირველი კვანძთაშუა (IN1), მეორე კვანძთაშუა (IN2), მესამე კვანძთაშუა (IN3), კვანძთაშუა (IN4) და კვანძთაშუა (IN5) Nanlin895-დან
NGS- თანმიმდევრობა:15 ინდივიდის რნმ იყო გაერთიანებული, როგორც ერთი ბიოლოგიური ნიმუში.თითოეული წერტილის სამი ბიოლოგიური რეპლიკა დამუშავდა NGS თანმიმდევრობისთვის
TGS- თანმიმდევრობა:ღეროვანი რეგიონები დაიყო სამ რეგიონად, ანუ მწვერვალად, IN1-IN3 და IN4-IN5.თითოეული რეგიონი დამუშავდა PacBio თანმიმდევრობისთვის ოთხი ტიპის ბიბლიოთეკებით: 0-1 კბ, 1-2 კბ, 2-3 კბ და 3-10 კბ.
ძირითადი შედეგები
1. სულ იდენტიფიცირებულია 87150 სრულმეტრაჟიანი ტრანსკრიპტი, რომლებშიც იდენტიფიცირებული იყო 2081 ახალი იზოფორმა და 62058 ახალი ალტერნატიული დაშლილი იზოფორმა.
გამოვლენილია 2.1187 lncRNA და 356 შერწყმის გენი.
3. პირველადი ზრდადან მეორად ზრდამდე, გამოვლინდა 15838 დიფერენციალურად გამოხატული ტრანსკრიპტი 995 დიფერენციალურად გამოხატული გენიდან.ყველა DEG-ში 1216 იყო ტრანსკრიფციის ფაქტორი, რომელთა უმეტესობა ჯერ არ არის მოხსენებული.
4.GO გამდიდრების ანალიზმა გამოავლინა უჯრედების გაყოფისა და დაჟანგვა-აღდგენის პროცესის მნიშვნელობა პირველად და მეორად ზრდაში.
ალტერნატიული შეჯვარების მოვლენები და სხვადასხვა იზოფორმები
WGCNA ანალიზი ტრანსკრიპციის ფაქტორებზე
მითითება
Chao Q, Gao ZF, Zhang D და სხვ.Populus ფუძის ტრანსკრიპტომის განვითარების დინამიკა.მცენარეთა ბიოტექნოლოგი J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
