METAGENOMI
Genom bakteri sing lengkap lan ditutup saka mikrobioma nggunakake urutan nanopore
Urutan Nanopore |Metagenomik |MAG |Sirkularisasi genom bakteri |Mikrobiota usus
Sorotan
1. Cara anyar kanggo ngekstrak fragmen DNA sing dawa ditampilake ing panliten iki, sing entuk ekstraksi mikrogram DNA HMW murni sing cocog kanggo urutan sing diwaca dawa saka 300 mg tinja.
2.Alur kerja perakitan, Bubut, ditepungake ing panliten iki, ing ngendi MAG dirakit kanthi maca dawa lan didandani kanthi maca cekak.
3. Lathe dievaluasi kanthi campuran mock.7 saka 12 bakteri kasil diklumpukake dadi siji contigs lan 3 dirakit dadi papat utawa kurang contigs.
4.Lathe iki luwih Applied kanggo conto dhingklik, kang kui 20 genom circularized, kalebu Prevotella copri lan calon Cibiobacter sp., sing dikenal minangka sugih ing unsur genetik seluler.
Prestasi Utama
Protokol ekstraksi kanggo DNA HWM
Pasinaon metagenomik usus adhedhasar urutan sing dawa wis suwe ngalami kekerasan nalika ngekstrak DNA bobot molekul dhuwur (HMW) saka bangkekan.Ing panliten iki, protokol ekstraksi adhedhasar enzim dienalake kanggo nyegah nyukur ekstensif kanthi ngalahake manik kanthi cara tradisional.Kaya sing dituduhake ing gambar ing ngisor iki, conto pisanan diolah nganggo koktail enzim, kalebu enzim litik, MetaPolyzyme, lan liya-liyane kanggo ngrusak tembok sel.DNA sing dibebasake diekstraksi nganggo sistem Phenol-chloroform, disusul karo pencernaan Proteinase K lan RNase A, pemurnian berbasis kolom lan pilihan ukuran SPRI.Cara iki bisa ngasilake mikrogram DNA HMW saka 300 m bangkekan, sing nyukupi syarat urutan sing wis suwe diwaca saka segi kualitas lan kuantitas.
Gambar 1. Skema ekstraksi DNA HWM
Skema aliran saka Lathe
Kaya sing diterangake ing gambar ing ngisor iki, Bubut ngemot proses proses basecall mentah sing wis ana nggunakake Guppy.Rong rakitan sing wis suwe diwaca banjur diprodhuksi dening Flye lan Canu kanthi kapisah, banjur deteksi lan mbusak salah perakitan.Loro sub-assemblies digabung karo quickmerge.Sawise gabung, rakitan gedhe ing tingkat megabase banjur dicenthang kanggo circularization.Salajengipun, refinement konsensus ing rakitan kasebut diproses kanthi maca cekak.Génom bakteri sing dirakit pungkasan diproses kanggo deteksi lan penghapusan sing salah.
Gambar 2. Skema alur perakitan Bubut
Evaluasi Bubut kanthi campuran bakteri mock
Campuran standar ATCC 12-spesies sing kalebu bakteri Gram-positif lan Gram-negatif digunakake kanggo ngevaluasi kinerja platform urutan nanopore lan Bubut ing perakitan MAG.Data total 30,3 Gb digawe dening platform nanopore kanthi N50 5,9 kb.Lathe akehe apik perakitan N50 kanggo 1.6 kanggo 4-fold dibandhingake alat perakitan dawa-maca liyane lan 2 kanggo 9-fold dibandhingake alat perakitan hybridd.Saka 12 génom bakteri, pitu dirakit dadi siji contigs (Gambar 3. Circos karo titik ireng).Telu liyane padha dirakit dadi papat utawa kurang contigs, kang rakitan paling pepak ngemot 83% saka génom ing contig siji.
Gambar 3. Rakitan genom ing campuran bakteri 12 spesies sing ditetepake
Aplikasi Bubut ing sampel bangku
Cara iki luwih ditrapake kanggo conto bangku manungsa kanggo mbandhingake identifikasi organisme lan keterkaitan perakitan karo metode sing ana, maca awan lan analisis adhedhasar maca cekak.Saka telung conto sing melu, ekstraksi adhedhasar enzim anyar ngasilake paling ora 1 μg saben 300 mg massa input.Urutan nanopore saka DNA HMW iki ngasilake dawa maca kanthi N50 masing-masing 4.7 kb, 3.0kb lan 3.0kb.Utamane, metode saiki nuduhake potensial gedhe ing deteksi mikroba dibandhingake karo metode sing wis ana.Keragaman alpha tingkat spesies sing relatif luwih dhuwur dituduhake ing kene dibandhingake karo short-read lan read-cloud.Kajaba iku, kabeh genera saka analisis cekak diwaca, sanajan organisme Gram-positif sing biasane tahan lisis, dipulihake kanthi cara iki.
Gambar 4. Keragaman alfa lan komponen taksonomi sing ditemtokake dening Nanopore, metode short-read lan read-cloud
Lathe ngasilake N50 sing luwih dawa tinimbang perakitan sing diwaca lan diwaca awan, sanajan ana input data mentah telu nganti enem kali luwih murah.Draf génom diprodhuksi dening contig binning, ing ngendi draf kasebut diklasifikasikake dadi "berkualitas tinggi" utawa "parsial" adhedhasar kelengkapan, kontaminasi, gen inti salinan tunggal, lan liya-liyane. kanggo short-read lan read-cloud.
Figure 5. Per-organisme perakitan contiguity saben cara
Kajaba iku, pendekatan perakitan saiki bisa ngasilake genom bunder sing ditutup.Ing conto bangku, wolung genom siji-contig sing berkualitas tinggi diklumpukake lan lima kasebut entuk sirkulasi percise.Pendekatan sing diwaca kanthi dawa uga nuduhake kapasitas sing nyengsemake kanggo ngrampungake unsur sing bola-bali ing génom.CircularizedP. coprigenom digawe kanthi pendekatan iki, sing wis dikenal ngemot pengulangan urutan tingkat dhuwur.Rakitan paling apik saka génom iki kanthi short-read lan read-cloud ora tau ngluwihi N50 saka 130 kb, sanajan kanthi ambane jangkoan 4800X.Unsur nomer salinan sing dhuwur iki ditanggulangi kanthi pendekatan sing diwaca kanthi dawa, sing asring ditemokake ing titik-titik rusak saka rakitan sing diwaca cekak utawa awan.Genom tertutup liyane dilapurake ing panliten iki, sing dipercaya minangka anggota sing diterangake bubarCibiobacterclade.Lima phage putative diidentifikasi ing rapat tertutup iki, wiwit saka 8,5 nganti 65,9 kb.
Gambar 6. Diagram sirkos genom tertutup P.copri dan Cibiobacter sp.
Referensi
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Genom bakteri sing lengkap lan ditutup saka mikrobioma nggunakake urutan nanopore.Bioteknologi alam,38(6), 701-707.
Tech lan Highlights ngarahake nuduhake aplikasi sukses paling anyar saka macem-macem teknologi sekuensing dhuwur ing macem-macem arena riset uga ide sing apik ing desain eksperimen lan pertambangan data.
Wektu kirim: Jan-07-2022