Full-Length mRNA Sequencing-Nanopore

Urutan RNA wis dadi alat sing penting kanggo analisis transkriptom lengkap.Mesthi, urutan maca cekak tradisional entuk akeh pangembangan penting ing kene.Nanging, asring nemoni watesan ing identifikasi isoform lengkap, kuantifikasi, bias PCR.

Urutan nanopore mbedakake dhewe saka platform urutan liyane, amarga nukleotida diwaca langsung tanpa sintesis DNA lan ngasilake maca dawa ing puluhan kilobase.Iki nguatake transkrip lengkap sing diwaca langsung lan ngatasi tantangan ing studi tingkat isoform.

Platform:Nanopore PromethION

Pustaka:cDNA-PCR

Hubungi Kita

Rincian Layanan

Asil Demo

Studi Kasus

Kaluwihan Service

● Low urutan bias

● Ngungkapake molekul cDNA lengkap

● Kurang data sing dibutuhake kanggo nutupi jumlah transkrip sing padha

● Identifikasi macem-macem isoform saben gen

● Kuantifikasi ekspresi ing tingkat isoform

Spesifikasi Layanan

Pustaka

Platform

Ngasilake data sing disaranake (Gb)

Kontrol kualitas

cDNA-PCR (Poly-A enriched)

Nanopore PromethION P48

6 Gb/sampel (Gumantung saka spesies)

Rasio dawa lengkap> 70%

Skor kualitas rata-rata: Q10

Analisis bioinformatika

●Pangolahan data mentah

● Identifikasi transkrip

● splicing alternatif

● Kuantifikasi ekspresi ing tingkat gen lan tingkat isoform

● Analisis ekspresi diferensial

● Anotasi lan pengayaan fungsi (DEG lan DET)

Syarat Sampel lan Pangiriman

Syarat Sampel:

Nukleotida:

Konk.(ng/μl)

Jumlah (μg)

Kemurnian

Integritas

≥ 100

≥ 0,6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0,5-2,5

Kontaminasi protein utawa DNA diwatesi utawa ora ditampilake ing gel.

Kanggo tetanduran: RIN≥7.0;

Kanggo kewan: RIN≥7.5;

5.0≥28S/18S≥1.0;

winates utawa ora elevasi baseline

Tisu: Bobot (garing): ≥1 g

*Kanggo jaringan sing luwih cilik saka 5 mg, disaranake ngirim sampel jaringan flash beku (ing nitrogen cair).

Suspensi sel: Jumlah sel = 3×10⁶- 1×10⁷

* Disaranake ngirim lysate sel beku.Yen jumlah sel luwih cilik tinimbang 5 × 10⁵, lampu kilat beku ing nitrogen cair dianjurake, sing luwih disenengi kanggo ekstraksi mikro.

Sampel getih: Volume≥1 ml

Pangiriman Sampel sing Disaranake

Wadah: 2 ml tabung centrifuge (Timah foil ora dianjurake)

Labeling sampel: Group+replikat contone A1, A2, A3;B1, B2, B3....

Kintunan: 2, Es garing: Sampel kudu dikemas ing tas lan dikubur ing es garing.

Tabung RNAstable: Sampel RNA bisa dikeringake ing tabung stabilisasi RNA (umpamane RNAstable®) lan dikirim ing suhu kamar.

Alur Kerja Layanan

Nukleotida:

pangiriman sampel

Konstruksi perpustakaan

Sequencing

Analisis data

Layanan sawise-sale

Alur Kerja Layanan

Tisu:

Desain eksperimen

pangiriman sampel

Ekstraksi RNA

Konstruksi perpustakaan

Sequencing

Analisis data

Layanan sawise-sale

Sadurunge: Urutan mRNA lengkap -PacBio

Sabanjure: 10x Transkriptom Spasial Visium Genomics

1.Analisis ekspresi diferensial -Plot gunung berapi

Analisis ekspresi diferensial bisa diproses ing tingkat gen kanggo ngenali gen sing diungkapake kanthi beda (DEGs) lan ing tingkat isoform kanggo ngenali sacara diferensial.

3(1)

Transkrip Ekspresi (DET)

2.Peta panas clustering hirarkis

3. Identifikasi lan klasifikasi splicing alternatif

Lima jinis acara splicing alternatif bisa diprediksi dening Astalavista.

4.Identifikasi lan Motif acara poli-adenilasi (APA) alternatif ing 50 bp hulu poli-A

Kasus BMK

Identifikasi splicing alternatif lan kuantifikasi tingkat isoform kanthi urutan transkriptom lengkap nanopore

Diterbitake:Komunikasi Alam, 2020

Strategi urutan:

Pengelompokan: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(mutasi K700E);3. Sel B normal

Strategi urutan: urutan perpustakaan Minion 2D, urutan perpustakaan PromethION 1D;data cekak diwaca saka conto sing padha

Platform urutan: Nanopore Minion;Nanopore PromethION;

Asil kunci

1.Isoform-tingkat Alternatif Splicing Identifikasi

Urutan sing diwaca kanthi dawa ngidini identifikasi mutant SF3B1^K700E-ngubah situs splice ing tingkat isoform.35 alternatif 3′SSs lan 10 alternatif 5′SSs ditemokake sacara signifikan disambungake antarane SF3B1^K700Elan SF3B1^WT.33 saka 35 owah-owahan anyar ditemokake kanthi urutan sing dawa diwaca.

2.Isoform-tingkat Alternatif Splicing kuantifikasi

Ekspresi isoform retensi intron(IR) ing SF3B1^K700Elan SF3B1^WTdiukur adhedhasar urutan nanopore, ngungkapake regulasi global isoform IR ing SF3B1^K700E.

Referensi

Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Karakterisasi transkrip lengkap mutasi SF3B1 ing leukemia limfositik kronis nuduhake downregulation saka intron sing ditahan [J].Komunikasi Alam.