新型コロナウイルス感染症（COVID19）遺伝子変異の同定におけるナノポアベースの再配列決定の応用

全ゲノムの再配列決定

SARS-CoV-2のゲノミクスモニタリングにより、I型インターフェロン反応を調節するNsp1欠失変異体が明らかになった

Biomarker Technologies は、この研究におけるサンプル配列決定に関する技術サポートを提供しました。

ハイライト

1.SARS-CoV-2 のゲノム配列決定と系統解析により、31 個の SNP と 4 個のインデルを含む 35 個の再発性変異が特定されました。

2. 117 の臨床表現型との関連性により、潜在的な可能性が明らかになる
重要な突然変異。

Nsp1コード領域のΔ500-532はウイルス性の低下と相関する
3.負荷および血清IFN-β。

4.Δ500-532変異を持つウイルス分離株はIFN-Iの誘導を低下させる
感染した細胞の反応。

実験計画

業績

1. 新型コロナウイルス感染症の疫学およびゲノム調査

臨床データは、2020年1月22日から2020年2月20日までのアウトブレイク期間中に中国の四川省で収集されました。四川省では合計538人の新型コロナウイルス感染症感染者がqPCR検査によって確認され、そのうち28.8%が四川省出身者でした。資本。四川省の感染者数は指数関数的に増加し、1月30日にピークに達した。また、社会的距離がウイルスの蔓延を防ぐ重要な要素となり得ることをデータが裏付けています。

図 1. 中国四川省における新型コロナウイルス感染症の疫学調査

2. SARS-CoV-2 ゲノム構築と変異体の同定

マルチプレックス PCR 増幅とそれに続くナノポア配列決定により、248 人の患者から合計 310 個のほぼ完全または部分的に完全なゲノムが生成されました。ゲノムの 80% が 10 リードでカバーされます (平均深さ: サンプルあたり 0.39 万リード)。

図 2. 四川コホートにおける各変異の頻度

合計 104 個の SNP と 18 個のインデルが SARS-CoV-2 ゲノムから同定され、そのうち 31 個の SNP と 4 個のインデルが再発性の遺伝的変異として同定されました。これらを武漢の169のサンプルおよびGISAIDの81,391の高品質公衆ゲノム配列と比較したところ、35の変異体のうち29個が他の大陸に存在することが判明した。注目すべきことに、Δ500-532、ACC18108AT、Δ729-737、T13243Cを含む4つの変異株は四川省と武漢にのみ存在することが判明し、GISAIDデータには存在しないことから、これらの変異株は武漢から移入された可能性が非常に高いことが示されており、患者さんの旅行記録。

最尤法 (ML) 法とベイジアン分子時計アプローチによる進化分析は、四川省からの 88 の新しいウイルスと他の地域からの 250 の精選されたゲノムに対して処理されました。Δ500-532 (Nsp1 コード領域の欠失) を持つゲノムが系統樹にまばらに分布していることがわかりました。Nsp1 バリアントのハプロタイプ分析により、複数の都市からそのうち 5 つが特定されました。これらの結果は、Δ500-532が複数の都市で発生し、武漢から複数回持ち込まれた可能性があることを示唆しました。

図 2. SARS-CoV-2 ゲノムにおける再発性の遺伝子変異と系統解析

3. 再発する遺伝子変異と臨床的意義との関連性

117 の臨床表現型が COVID-19 の重症度と関連しており、19 の重症度関連表現型が重症形質と非重症形質に分類されました。これらの形質と 35 の再発遺伝子変異との関係が、バイクラスターヒートマップで視覚化されました。GSEA のようなランク付けされた濃縮分析では、Δ500 ～ 532 が ESR、血清 IFN-β、および血液中の CD3+CD8+ T 細胞数と負の相関があることが示されました。さらに、qPCR 検査では、Δ500-532 を有するウイルスに感染した患者の Ct 値が最も高く、つまりウイルス量が最も低いことが示されました。

図 3. 35 の再発遺伝子変異と臨床表現型の関連性

4. ウイルス変異に関連する臨床表現型の検証

Nsp1 機能に対するΔ500-532 の影響を理解するために、HEK239T 細胞に、全長、WT Nsp1、および欠失のある変異型を発現するプラスミドをトランスフェクトしました。処理した各 HEK239T 細胞のトランスクリプトームプロファイルを PCA 分析用に処理したところ、欠失変異体が比較的近くにクラスター化しており、WT Nsp1 とは大きく異なることが示されました。変異体で有意に上方制御された遺伝子は、主に「ペプチド生合成/代謝プロセス」、「リボ核タンパク質複合体生合成」、「膜/ERへのタンパク質標的化」などに富んでいた。さらに、2つの欠失はWTとは異なる発現パターンを示した。

図 4. WT Nsp1 をトランスフェクトした HEK239T 細胞および欠失のある HEK239T 細胞のトランスクリプトーム解析

IFN-1 応答に対する欠失の影響も過剰発現研究で試験されました。試験したすべての欠失は、トランスクリプトームレベルとタンパク質レベルの両方で、トランスフェクトされた HEK239T 細胞および A549 細胞における IFN-1 応答を低下させることが示されました。興味深いことに、欠失内の有意に下方制御された遺伝子は、「ウイルスに対する防御応答」、「ウイルスゲノム複製」、「RNAポリメラーゼIIによる転写制御」、および「I型インターフェロンに対する応答」が豊富でした。