全長mRNAシーケンシング - PacBio
サービスのメリット
● 全長 cDNA 分子の 3' 末端から 5' 末端までの直接読み取り
● シーケンス構造におけるアイソフォームレベルの解像度
● 高い精度と完全性を備えたトランスクリプト
●バオール種との親和性が高い。
● 4 つの PacBio Sequel II シーケンス プラットフォームを搭載した大規模なシーケンス能力
● 700 を超える Pacbio ベースの RNA シーケンス プロジェクトにおける豊富な経験
● BMKCloud ベースの結果配信: プラットフォーム上でカスタマイズされたデータ マイニングが利用可能です。
● プロジェクト完了後 3 か月間有効なアフターサービス
サービス仕様
プラットフォーム: PacBio Sequel II
シーケンスライブラリ: ポリ A が豊富な mRNA ライブラリ
推奨されるデータ収量: 20 Gb/サンプル (種によって異なります)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: 完全長の非キメラ転写産物
バイオインフォマティクス分析
●生データ処理
● 転写物の識別
●シーケンス構造
● 発現の定量化
● 関数アノテーション
サンプルの要件と納品
サンプル要件:
ヌクレオチド:
| 濃度(ng/μl) | 量（μg） | 純度 | 誠実さ |
| ≥ 120 | ≧ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5～2.5 ゲル上にタンパク質や DNA の汚染はほとんど見られないか、まったく見られません。 | 植物の場合: RIN≥7.5; 動物の場合：RIN≧8.0。 5.0≧28S/18S≧1.0; 基準高度が限られているか、基準高度がない |
組織: 重量(乾燥):≧1g
※5 mg未満の組織については、急速冷凍（液体窒素）した組織サンプルをお送りいただくことをお勧めします。
細胞懸濁液:セル数 = 3×106- 1×107
※細胞ライセートは凍結して発送することをお勧めします。セル数が5×10未満の場合5、液体窒素で急速冷凍することをお勧めします。これは微量抽出に適しています。
血液サンプル：容量≧1mL
微生物:質量 ≥ 1 g
推奨されるサンプル配信
容器：
2 ml 遠沈管 (錫箔は推奨しません)
ラベル付けのサンプル: グループ + 複製 (A1、A2、A3 など)。B1、B2、B3……
出荷:
1. ドライアイス: サンプルを袋に詰めてドライアイスに埋める必要があります。
2. RNAstable チューブ: RNA サンプルは RNA 安定化チューブ (例: RNAstable®) 内で乾燥され、室温で出荷されます。
サービスのワークフロー
実験計画
サンプル納品
RNA抽出
図書館の建設
シーケンス
データ分析
アフターサービス
1.FLNCの長さ分布
全長非キメラリード(FLNC)の長さは、ライブラリ構築時のcDNAの長さを示します。FLNC の長さの分布は、ライブラリ構築の品質を評価する際の重要な指標です。
FLNC 読み取り長の分布
2.完全なORF領域長分布
TransDecoder を使用してタンパク質コード領域と対応するアミノ酸配列を予測し、すべてのサンプルに完全な非重複転写情報を含むユニジーン セットを生成します。
完全なORF領域長分布
3.KEGG経路濃縮解析
差次的に発現された転写産物（DET）は、NGS ベースの RNA シーケンシング データを、PacBio シーケンシング データによって生成された全長転写物セット上でアラインメントすることによって同定できます。これらの DET は、KEGG 経路濃縮分析など、さまざまな機能分析のためにさらに処理できます。
DET KEGG 経路濃縮 - ドット プロット
BMKケース
Populus ステムトランスクリプトームの発生動態
公開日: 植物バイオテクノロジージャーナル、2019年
シーケンス戦略:
サンプルコレクション:幹領域: 頂点、第 1 節間 (IN1)、第 2 節間 (IN2)、第 3 節間 (IN3)、節間 (IN4) および節間 (IN5) (Nanlin895 より)
NGS シーケンス:15 人の RNA が 1 つの生体サンプルとしてプールされました。各ポイントの 3 つの生物学的複製が NGS シーケンス用に処理されました
TGS シーケンス:ステム領域は、頂点、IN1 ～ IN3、および IN4 ～ IN5 の 3 つの領域に分割されました。各領域は、4 種類のライブラリー (0 ～ 1 kb、1 ～ 2 kb、2 ～ 3 kb、および 3 ～ 10 kb) を使用して PacBio シークエンシング用に処理されました。
主な結果
1.合計 87150 個の完全長転写産物が同定され、そのうち 2081 個の新規アイソフォームと 62058 個の新規オルタナティブ スプライシング アイソフォームが同定されました。
2,1187 個の lncRNA および 356 個の融合遺伝子が同定されました。
3.一次増殖から二次増殖まで、995 個の発現差のある遺伝子から 15,838 個の発現差のある転写物が同定されました。すべての DEG のうち、1216 個が転写因子でしたが、そのほとんどはまだ報告されていません。
4.GO濃縮分析により、一次および二次成長における細胞分裂と酸化還元プロセスの重要性が明らかになりました。
選択的スプライシング イベントとさまざまなアイソフォーム
転写因子のWGCNA解析
参照
Chao Q、Gao ZF、Zhang D 他Populus ステムトランスクリプトームの発生ダイナミクス。Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219。土井:10.1111/pbi.12958
