מטאגנומיה
גנום חיידקי שלם וסגור ממיקרוביום באמצעות רצף ננופורי
Nanopore Sequencing |מטאגנומיקה |MAGs |מחזור גנום חיידקי |מיקרוביוטה במעיים
עיקרי הדברים
1. שיטה חדשה לחילוץ שברי DNA ארוכים הוצגה במחקר זה, שהשיגה מיצוי של מיקרוגרם של HMW DNA טהור המתאים לרצף קריאה ארוך מ-300 מ"ג של צואה
2. זרימת עבודה של הרכבה, Lathe, הוצגה במחקר זה, שבו MAGs הורכבו על ידי קריאה ארוכה ותוקנו על ידי קריאה קצרה.
3. מחרטה הוערך על ידי תערובת מדומה.7 מתוך 12 חיידקים הורכבו בהצלחה לקונטיגים בודדים ו-3 הורכבו לארבעה או פחות.
4. מחרטה יושמה עוד על דגימות צואה, שיצרו 20 גנומים מעגליים, כולל Prevotella copri והמועמד Cibiobacter sp., שהיו ידועים בהיותם עשירים באלמנטים גנטיים ניידים.
הישג עיקרי
פרוטוקול מיצוי עבור HWM DNA
מחקרים מטאנומיים המבוססים על רצף קריאה ארוך סבלו זמן רב מקשיות בהפקת DNA במשקל מולקולרי גבוה (HMW) מהצואה.במחקר זה, הוצג פרוטוקול מיצוי מבוסס אנזים כדי למנוע גזירה נרחבת על ידי הכפת חרוזים בשיטות מסורתיות.כפי שמוצג באיור הבא, הדגימות טופלו תחילה בקוקטייל של אנזימים, כולל אנזים ליטי, MetaPolyzyme וכו' כדי לפרק את דפנות התא.ה-DNA המשוחרר הוצא על ידי מערכת פנול-כלורופורם, ואחריו עיכול Proteinase K ו-RNase A, טיהור מבוסס עמודות ובחירת גודל SPRI.שיטה זו הצליחה להניב מיקרוגרם של HMW DNA מ-300 מ' של צואה, אשר עונה על דרישות רצף קריאה ארוך מבחינת איכות וכמות.
איור 1. ערכת מיצוי DNA של HWM
זרימת תכנית של מחרטה
כפי שמתואר באיור הבא, מחרטה מכילה תהליך קיים של תהליך בסיס גולמי באמצעות Guppy.שני מכלולים שנקראו ארוכות מיוצרים לאחר מכן על ידי Flye ו-Canu בנפרד ולאחר מכן זיהוי והסרה של הרכבה שגויה.שני מכלולי המשנה מתמזגים עם quickmerge.לאחר המיזוג, מכלולים גדולים ברמת מגה-בסיס נבדקים אם יש מעגלים.לאחר מכן, חידוד הקונצנזוס על הרכבות אלה מעובד בקריאה קצרה.גנום חיידקי סופי שנאסף מעובד לזיהוי והסרה סופית של הרכבה שגויה.
איור 2. זרימת סכימה של מכלול מחרטה
הערכה של מחרטה עם תערובת חיידקים מדומה
תערובת ATCC סטנדרטית של 12 מינים הכוללת גם חיידקים גראם חיוביים וגם גראם שליליים הופעלה כדי להעריך את הביצועים של פלטפורמת רצף ננופורית ומחרטה בהרכבת MAG.סך של נתונים של 30.3 ג'יגה-בייט נוצרו על-ידי פלטפורמת nanopore עם N50 של 5.9 ק"ב.המחרטה שיפרה במידה רבה את המכלול N50 לפי 1.6 עד פי 4 בהשוואה לכלי הרכבה אחרים בעלי קריאה ארוכה ופי 2 עד פי 9 בהשוואה לכלי הרכבה היברידיים.מתוך 12 גנומים חיידקיים, שבעה הורכבו לקונטיגים בודדים (איור 3. Circos עם נקודה שחורה).שלושה נוספים הורכבו לארבעה או פחות קונטיגים, שבהם ההרכבה הבלתי שלמה הכילה 83% מהגנום בקונטיג בודד.
איור 3. מכלולי גנום בתערובת חיידקים מוגדרת של 12 מינים
יישום מחרטה בדגימות צואה
שיטה זו יושמה עוד יותר על דגימות צואה אנושיות על מנת להשוות את זיהוי האורגניזם וצמידות ההרכבה לשיטות קיימות, ניתוח מבוסס קריאה בענן וקריאה קצרה.משלוש הדגימות המעורבות, המיצוי החדש מבוסס האנזים הניב לפחות 1 מיקרוגרם לכל 300 מ"ג של מסת קלט.ריצוף Nanopore של HMW DNA אלה יצר קריאות ארוכות עם N50 של 4.7 kb, 3.0 kb ו-3.0 kb בהתאמה.יש לציין, השיטה הנוכחית הראתה פוטנציאל רב בזיהוי חיידקים בהשוואה לשיטות הקיימות.מגוון אלפא גבוה יחסית ברמת המינים הוצג כאן בהשוואה לקריאה קצרה ולענן קריאה.יתרה מזאת, כל הסוגים מניתוח קצר, אפילו אורגניזמים עמידים ל-Lisis עמידים בדרך כלל, נמצאו בשיטה זו.
איור 4. מגוון אלפא ורכיבים טקסנומיים נקבעים על ידי שיטות Nanopore, קריאה קצרה וקריאה-ענן
המחרטה הניבה N50 מכלול שלם ארוך בהרבה מהרכבה קצרה וקריאה-ענן, למרות קלט נמוך פי שלושה עד שישה של נתונים גולמיים.גנומי טיוטה הופקו על ידי contig binning, שבו הטיוטה סווגו ל"איכות גבוהה" או "חלקית" על סמך שלמות, זיהום, גנים ליבה בעותק בודד וכו'. הרכבה לקריאה ארוכה הראתה צמידות גבוהה בהרבה בעלות נמוכה יותר בהשוואה לקריאה קצרה ולקריאה-ענן.
איור 5. צמידות לכל אורגניזם של כל שיטה
יתר על כן, גישת ההרכבה הנוכחית מסוגלת להניב גנומים סגורים ומעגליים.בדגימות הצואה הורכבו שמונה גנומים איכותיים בעלי חיבור יחיד וחמישה מהם השיגו מעגליות מדויקת.גישה לקריאה ארוכה הראתה גם יכולת מרשימה בפתרון אלמנטים שחוזרים על עצמם בגנום.במעגלפ.קופריהגנום נוצר על ידי גישה זו, אשר ידועה כמכילה רמה גבוהה של חזרה על רצף.ההרכבה הטובה ביותר של הגנום הזה על ידי קריאה קצרה וקריאה-ענן מעולם לא עלתה על N50 של 130 kb, אפילו עם עומק כיסוי של 4800X.רכיבי מספר עותקים גבוהים אלה נפתרו במלואם על ידי גישה לקריאה ארוכה, אשר נמצאה לעתים קרובות בנקודות שבירה של מכלולי קריאה קצרה או קריאה-ענן.גנום סגור נוסף דווח במחקר זה, אשר האמינו שהוא חבר במחקר שתואר לאחרונהCibiobacterקליד.חמישה פאגים משוערים זוהו במכלול סגור זה, בטווח שבין 8.5 ל-65.9 קילובייט.
איור 6. דיאגרמת Circos של גנומים סגורים של P.copri ו- Cibiobacter sp.
התייחסות
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).גנום חיידקי שלם וסגור ממיקרוביום באמצעות רצף ננופורי.ביוטכנולוגיה של הטבע,38(6), 701-707.
טכנולוגיה והדגשים שואפת לחלוק את היישום המוצלח האחרון של טכנולוגיות רצף שונות בתפוקה גבוהה בזירות מחקר שונות, כמו גם רעיונות מבריקים בתכנון ניסיוני ובכריית נתונים.
זמן פרסום: ינואר-07-2022