גנומיקה אנושית
גנטיקה של הטבע
רצף קריאה ארוך מזהה הרחבות חוזרות של GGC ב- NOTCH2NLC הקשורות למחלת הכללה תוך גרעינית עצבית
ריצוף מחדש של ONT |אילומינה |רצף אקסום שלם |רצף ממוקד CRISPR-Cas9 ONT |RNA-seq |קריאת מתילציה ONT 5mC
עיקרי הדברים
1. על ידי ניתוח קישור על משפחת NIID גדולה, זוהו שני אזורים מקושרים.
רצף 2.ONT מבוסס קריאה ארוכה ורצף ONT העשרה בתיווך Cas-9 גילה גורם גנטי פוטנציאלי להרחבות חוזרות של NIID, GGC ב-5′ UTR של NOTCH2NLC.מחקר זה דיווח על הרחבות חוזרות בגנים ספציפיים לאדם בפעם הראשונה שהתפתחו באמצעות כפילויות מגזריות.
ריצוף 3.RNA חשף תעתיקי אנטי-סנס חריגים בהתחלה או בתוך אזורי התרחבות חוזרים של GGC ב- NOTCH2NLC.
רקע כללי
NEuronal intranuclear inclusion disease (NIID) היא מחלה נוירודגנרטיבית מתקדמת וקטלנית, המאופיינת בנוכחות של תכלילים תוך-גרעיניים eosinophilic Hyaline במערכת העצבים המרכזית והפריפריאלית.הביטויים הקליניים המשתנים ביותר שלו מעלים קשיים גדולים באבחון עד להכנסת ביופסיית עור.עם זאת, שיטות המבוססות על היסטופתולוגיה עדיין סובלות מאבחון שגוי, המחייב הבנה גנטית של NIID.
הישגים
ניתוח קישור
Sריצוף גנום מלא (WGS) ורצף אקסום שלם (WES) בוצעו על משפחת NIID גדולה (13 מושפעים ו-7 חברים לא מושפעים).ניתוח קישור על SNPs שחולצו מנתונים אלו גילה רק שני אזורים מקושרים: אזור של 3.5 מגה-ביט ב-1p36.31-p36.22 (מקסימום LOD=2.32) ואזור של 58.1 מגה-ביט ב-1p22.1-q21.3 (מקסימום LOD: 4.21 ).עם זאת, לא זוהו SNPs או CNVs פתוגניים באזורים מקושרים אלה.
הרחבות חוזרות של GGC ב- NOTCH2NLC
Nריצוף מבוסס-anopore עובד על 13 חברים מושפעים ו-4 לא מושפעים מ-8 משפחות (חבר מושפע אחר רושם על ידי Pacbio long read רצף פלטפורמת).נתונים מזמן קריאה חשפו הרחבות חוזרות של GGC הקשורות למחלה ב-5′ UTR של מיפוי הגנים NOTCH2NLC לאזור מקושר של 58.1 Mb (איור 1).הרחבות חוזרות אלו זוהו גם בכל 40 מקרי ה-NIID הספורדיים שנבדקו על ידי RP-PCR.
Cנעשה שימוש ברצף יעדים בתיווך as-9 על פלטפורמת nanopore כדי להשיג כיסוי קריאה גבוה יותר בחזרה של NOTCH2NLC (100 X-1,795 X).רצפי קונצנזוס אלה תאמו היטב את הממצאים הקודמים על הרחבות חוזרות של GGC.יתרה מכך, {(GGA)n (GGC)n}n חזרות זוהו כסמן גנטי פוטנציאלי לפנוטיפ דומיננטי בחולשה (איור 2).
איור 1. התרחבות חוזרת הקשורה למחלה זוהתה באקסון 1 של איזופורמים NOTCH2NLC.
איור 2. רצפי קונצנזוס של NPTCH2NLC חוזר בחולי NIID עם(*) או ללא פנוטיפ דומיננטי בחולשה
Nגנים OTCH2NL הם גנים ספציפיים לאדם, אשר מאמינים כי הם ממלאים תפקיד חיוני באבולוציה של המוח האנושי ומחלות נוירולוגיות.עם זאת, שלושה גנים הקשורים ל- NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB ו- NOTCH2NLC) בעלי זהות של יותר מ-99.1% ברצף לא נפתרו עד להרכבת הגנום האנושי האחרון.רצף ללא סינתזה וקריאה ארוכה על פלטפורמת nanopore הראו יתרונות בולטים בפתרון אזורים בעלי דמיון גבוה וחזרות (GGC)n עם 100% עשירים ב-GC.
הרחבות חוזרות של GGC ב- NOTCH2NLC
Tרצף רנסקריפטום עובד על 2 חברים מושפעים ו-2 לא מושפעים.עומק קריאה מנורמל חושב על גדילי חוש ואנטי-חוש במעלה הזרם של האקסונים הראשונים של פרלוגים NOTCH2NL.תמלול אנטי-חושים חריג נמצאו רק במקרים מושפעים, אשר יושבים בתחילת או בתוך אזור ההתפשטות החוזרת (פסגות סגולות ב-F1-14 ו-F1-16 באיור 3.).בנוסף, זוהו 54 DEG וכולם הועשרו במונחי GO ו-MPO הקשורים לתפקודים נוירונים.
איור 3. עומק קריאה מנורמל במעלה הזרם של האקסון הראשון של NOTCH2NLC במקרים לא מושפעים (למעלה) ומושפעים (למטה).
טֶכנוֹלוֹגִיָה
אוקספורד ננופור טכנולוגיות (ONT)
Nרצף אנופורי מבדיל את עצמו מפלטפורמות רצף אחרות, בכך שהנוקלאוטידים נקראים ישירות ללא תהליך סינתזת DNA.כאשר DNA גדיל בודד עובר דרך נקבובית חלבון בגודל ננו (ננופורה), נוקלאוטידים שונים מייצרים זרמים יוניים שונים, אותם ניתן ללכוד ולהעביר לרצף של בסיסים.פלטפורמת רצף ONT עצמה אינה מציגה מגבלה טכנית לכאורה על אורך קריאת ה-DNA.לכן, קריאות ארוכות במיוחד (ULR) זמינות להרכבת גנום באיכות גבוהה.יתר על כן, קריאות ארוכות במיוחד אלה, שהן ארוכות מספיק כדי לחצות תכונות רצף מורכבות או וריאציות מבניות, עוזרות להתגבר על המגבלות של רצף קריאה קצרה כאן.
רצף Nanopore
זיהוי וריאציה של מבנה (SV).
Sרצף ללא ynthesis שמר במידה רבה מידע מתילציה של DNA על התבנית.A, T, C ו-G המתילטים מייצרים זרמים יוניים שונים מאלו שאינם מתילטים, אותם ניתן לקרוא ישירות על ידי הפלטפורמה.ריצוף Nanopore מעצים פרופיל גנום שלם של 5mC ו-6mA גם ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד.
התייחסות
יוני סונה, et.אל.רצף קריאה ארוך מזהה הרחבות חוזרות של GGC ב- NOTCH2NLC הקשורות למחלת הכללה תוך גרעינית עצבית.גנטיקה של הטבע (2019)
טכנולוגיה והדגשים שואפת לחלוק את היישום המוצלח האחרון של טכנולוגיות רצף שונות בתפוקה גבוהה בזירות מחקר שונות, כמו גם רעיונות מבריקים בתכנון ניסיוני ובכריית נתונים.
זמן פרסום: ינואר-06-2022