תמלול
טֶבַע
תקשורת
אפיון תמלול באורך מלא של מוטציית SF3B1 בלוקמיה לימפוציטית כרונית חושף הורדת ויסות של אינטרונים שנשמרו
תמלילים באורך מלא|רצף Nanopore|ניתוח איזופורמים אלטרנטיבי
רקע כללי
Sמוטציות אומטיות בגורם השחבור SF3B1 דווחו באופן נרחב כקשורות לסוגי סרטן שונים, כולל לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), מלנומה עורפית, סרטן השד וכו'. בנוסף, מחקרים תעתיקים קצרים חשפו דפוסי שחבור חריגים שנגרמו על ידי מוטציות SF3B1.עם זאת, מחקרים על דפוסי שחבור אלטרנטיביים אלה הוגבלו זה מכבר לרמת האירועים וחוסר ידע ברמת האיזופורמה בשל המגבלה של תמלילים מורכבים בקריאה קצרה.כאן, הוצגה פלטפורמת רצף ננופור כדי ליצור תמלילים באורך מלא, מה שהעצים בדיקה על איזופורמים AS.
עיצוב נסיוני
ניסויים
הַקבָּצָה:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E מוטציה);3. תאי B תקינים
אסטרטגיית רצף:רצף ספריית MinION 2D, רצף ספריית PromethION 1D;נתונים בקריאה קצרה מאותן דוגמאות
פלטפורמת רצף:ONT MinION;ONT PromethION;
ניתוח ביואינפורמטי
תוצאות
אסך של 257 מיליון קריאות נוצרו מ-6 דגימות CLL ו-3 תאי B.בממוצע 30.5% מהקריאות הללו זוהו כתמלילים באורך מלא.
Fניתוח איזופורמים אלטרנטיביים באורך מלא של RNA(FLAIR) פותח כדי ליצור קבוצה של איזופורמים בעלי ביטחון גבוה.ניתן לסכם את FLAIR כך:
Nanopore קורא יישור: זיהוי מבנה תמליל כללי על סמך גנום התייחסות;
Sתיקון צומת plice: תיקון שגיאות רצף (אדום) עם אתר splice משני אינטרונים מוערים, אינטרונים מנתוני קריאה קצרה או שניהם;
Collapse: סכם איזופורמים מייצגים המבוססים על שרשראות של צומת חיבור (סט מעבר ראשון).בחר isofrom בעל ביטחון גבוה בהתבסס על מספר קריאות תומכות (סף: 3).
איור 1. ניתוח FLAIR לזיהוי איזופורמים באורך מלא הקשורים למוטציה SF3B1 ב-CLL
FLAIR זיהה 326,699 איזופורמים שחבורים בעלי ביטחון גבוה, 90% מהם הם איזופורמים חדשים.רוב האיזופורמים ללא הערות אלו נמצאו כשילובים חדשים של חיבורים ידועים (142,971), בעוד שהשאר איזופורמים החדשים הכילו אינטררון שנשאר (21,700) או אקסון חדש (3594).
Lרצפי ong-read מאפשרים זיהוי של אתרי שחבור שהשתנו SF3B1-K700E מוטנטיים ברמת איזופורמה.נמצאו 35 SSs חלופיים 3'ות ו-10 חלופיים 5'SSs שחולקו בצורה דיפרנציאלית בין SF3B1-K700E ו-SF3B1-WT.33 מתוך 35 השינויים התגלו לאחרונה על ידי רצפים שנקראו ארוכות.בנתוני Nanopore, התפלגות המרחק בין SF3B1-K700E 3'SSs לשיאי אתרים קנוניים היא בסביבות -20 bp, אשר שונה משמעותית מהתפלגות בקרה, בדומה למה שדווח ברצפי קריאה קצרה של CLL.נותחו איזופורמים של הגן ERGIC3, כאשר איזופורם חדש המכיל את אתר השבר הפרוקסימלי נמצא בשפע יותר ב-SF3B1-K700E.גם 3'SS פרוקסימלי וגם דיסטלי היו קשורים לדפוסי AS מובחנים שיצרו איזופורמים מרובים.
איור 2. דפוסי שחבור אלטרנטיביים 3′ המזוהים עם נתוני רצף ננופוריים
ניתוח השימוש באירועי IR הוגבל זמן רב בניתוח מבוסס קריאה קצרה בשל ביטחון בזיהוי ובכימות IR.ביטוי של איזופורמים IR ב-SF3B1-K700E ו-SF3B1-WT כמתו על סמך רצפי ננו-פוריים, וחושפים ויסות מטה עולמי של איזופורמים IR ב-SF3B1-K700E.
איור 4. עוצמת חקלאות וקישוריות רשת על פני שלוש מערכות חקלאות (A ו-B);ניתוח יער אקראי (C) והקשר בין עוצמה חקלאית וקולוניזציה של AMF (D)
איור 3. אירועי החזקת אינטרונים מווסתים בצורה חזקה יותר ב-CLL SF3B1-K700E
טֶכנוֹלוֹגִיָה
Nanopore רצף קריאה ארוכה
Nרצף anopore הוא טכנולוגיית רצף אותות חשמליים מולקולה בודדת בזמן אמת.
DDNA או RNA בעל גדילים בעלי גדילים ייקשרו לחלבון ננו-נקבי המוטבע בביופילם ומתפרק תחת הובלת חלבון מוטורי.
Dגדילי NA/RNA עוברים דרך חלבון ערוץ ננופורי בקצב מסוים תחת פעולת הפרש מתחים.
Mאולקולות מייצרות אותות חשמליים שונים בהתאם למבנה הכימי.
Rזיהוי רצפים בזמן אמת מושג על ידי קריאת בסיס.
ביצועים של רצף תעתיק באורך מלא
√ רווית נתונים
נדרשות פי 7 פחות קריאות כדי להגיע לרווית נתונים דומה.
√ זיהוי מבנה תמלול
זיהוי של וריאנטים מבניים מגוונים עם קריאה בקונצנזוס באורך מלא של כל תמליל
√ ניתוח דיפרנציאלי ברמת התמלול - חשוף שינויים המוסתרים בקריאה קצרה
התייחסות
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.אפיון תמלול באורך מלא של מוטציית SF3B1 בלוקמיה לימפוציטית כרונית חושף הורדת ויסות של אינטרונים שנשמרו [J].תקשורת טבע.
טכנולוגיה והדגשים שואפת לחלוק את היישום המוצלח האחרון של טכנולוגיות רצף שונות בתפוקה גבוהה בזירות מחקר שונות, כמו גם רעיונות מבריקים בתכנון ניסיוני ובכריית נתונים.
זמן פרסום: ינואר-08-2022