METAGENOMICA
Genomi batterici completi e chiusi da microbiomi utilizzando il sequenziamento dei nanopori
Sequenziamento dei nanopori |Metagenomica |MAG |Circolarizzazione del genoma batterico |Microbiota intestinale
Punti salienti
1. In questo studio è stato presentato un nuovo metodo per estrarre lunghi frammenti di DNA, che ha ottenuto l'estrazione di microgrammi di DNA HMW puro adatto per il sequenziamento a lunga lettura da 300 mg di feci
2. In questo studio è stato introdotto un flusso di lavoro di assemblaggio, Lathe, in cui i MAG venivano assemblati mediante letture lunghe e corretti mediante letture brevi.
3.Il tornio è stato valutato mediante una miscela simulata.7 batteri su 12 sono stati assemblati con successo in singoli contig e 3 sono stati assemblati in quattro o meno contig.
4.Lathe è stato ulteriormente applicato a campioni di feci, che hanno generato 20 genomi circolarizzati, tra cui Prevotella copri e il candidato Cibiobacter sp., noti per essere ricchi di elementi genetici mobili.
Obiettivo principale
Protocollo di estrazione per DNA HWM
Gli studi metagenomici intestinali basati sul sequenziamento a lunga lettura sono stati a lungo penalizzati dalla durezza nell'estrazione del DNA ad alto peso molecolare (HMW) dalle feci.In questo studio è stato introdotto un protocollo di estrazione basato su enzimi per evitare un taglio eccessivo mediante battitura delle perle nei metodi tradizionali.Come mostrato nella figura seguente, i campioni sono stati prima trattati con un cocktail di enzimi, tra cui l'enzima litico, MetaPolyzyme, ecc. per degradare le pareti cellulari.Il DNA rilasciato è stato estratto mediante il sistema fenolo-cloroformio, seguito da digestione con proteinasi K e RNasi A, purificazione su colonna e selezione delle dimensioni SPRI.Questo metodo è riuscito a produrre microgrammi di DNA HMW da 300 m di feci, che soddisfano i requisiti di sequenziamento a lettura lunga in termini sia di qualità che di quantità.
Figura 1. Schema di estrazione del DNA HWM
Flusso dello schema del tornio
Come descritto nella figura seguente, Lathe contiene il processo esistente di elaborazione delle chiamate di base grezze utilizzando Guppy.Due assemblaggi a lettura lunga vengono quindi prodotti separatamente da Flye e Canu seguiti dal rilevamento e dalla rimozione degli assemblaggi errati.I due sottoassiemi vengono uniti con QuickMerge.Al momento della fusione, viene quindi verificata la circolarità degli assiemi di grandi dimensioni a livello di megabase.Successivamente, il perfezionamento del consenso su questi assembly viene elaborato con letture brevi.I genomi batterici assemblati finali vengono elaborati per il rilevamento e la rimozione finali di assemblaggi errati.
Figura 2. Schema di flusso dell'assemblaggio del tornio
Valutazione del tornio con miscela di batteri simulati
Per valutare le prestazioni della piattaforma di sequenziamento dei nanopori e del tornio nell'assemblaggio MAG è stata impiegata una miscela ATCC standard di 12 specie comprendente batteri Gram-positivi e Gram-negativi.Un totale di 30,3 Gb di dati è stato generato dalla piattaforma nanopore con N50 di 5,9 kb.Il tornio ha ampiamente migliorato l'assemblaggio N50 da 1,6 a 4 volte rispetto ad altri strumenti di assemblaggio a lettura lunga e da 2 a 9 volte rispetto agli strumenti di assemblaggio ibridi.Di 12 genomi batterici, sette sono stati assemblati in singoli contigui (Figura 3. Circos con punto nero).Altri tre sono stati assemblati in quattro o meno contig, in cui l'assemblaggio più incompleto conteneva l'83% del genoma in un singolo contig.
Figura 3. Assemblaggi di genomi in una miscela batterica definita di 12 specie
Applicazione del tornio nei campioni di feci
Questo metodo è stato ulteriormente applicato a campioni di feci umane per confrontare l'identificazione dell'organismo e la contiguità dell'assemblaggio con i metodi esistenti, l'analisi read-cloud e quella basata su short-read.Dai tre campioni coinvolti, la nuova estrazione a base di enzimi ha prodotto almeno 1 μg per 300 mg di massa in ingresso.Il sequenziamento dei nanopori di questo DNA HMW ha generato letture lunghe con N50 rispettivamente di 4,7 kb, 3,0 kb e 3,0 kb.In particolare, il metodo attuale ha mostrato un grande potenziale nel rilevamento microbico rispetto ai metodi esistenti.Qui è stata mostrata una diversità alfa a livello di specie relativamente più elevata rispetto a short-read e read-cloud.Inoltre, tutti i generi derivanti dall'analisi a lettura breve, anche gli organismi Gram-positivi tipicamente resistenti alla lisi, sono stati recuperati con questo metodo.
Figura 4. Diversità alfa e componenti tassonomici determinati con i metodi Nanopore, short-read e read-cloud
Lathe ha prodotto un intero assemblaggio N50 molto più lungo rispetto all'assemblaggio di lettura breve e di lettura cloud, nonostante un input di dati grezzi da tre a sei volte inferiore.Le bozze dei genomi sono state prodotte mediante contig binning, in cui le bozze sono state classificate in "alta qualità" o "parziali" in base a completezza, contaminazione, geni core a copia singola, ecc. L'assemblaggio a lettura lunga ha mostrato una contiguità molto più elevata a un costo inferiore rispetto a alla lettura breve e al read-cloud.
Figura 5. Contiguità dell'assemblaggio per organismo di ciascun metodo
Inoltre, l'attuale approccio di assemblaggio è in grado di produrre genomi chiusi e circolari.Nei campioni di feci sono stati assemblati otto genomi singoli contigui di alta qualità e cinque di questi hanno raggiunto una circolarizzazione precisa.L'approccio a lunga lettura ha inoltre mostrato una capacità impressionante nel risolvere elementi ripetitivi nei genomi.CircolarizzatoP.copriIl genoma è stato generato da questo approccio, che è noto per contenere un alto grado di ripetizione della sequenza.Il miglior assemblaggio di questo genoma mediante short-read e read-cloud non ha mai superato N50 di 130 kb, anche con una profondità di copertura di 4800X.Questi elementi con un numero elevato di copie sono stati completamente risolti dall'approccio a lettura lunga, che spesso si trova nei punti di rottura degli assiemi a lettura breve o read-cloud.In questo studio è stato riportato un altro genoma chiuso, che si ritiene faccia parte di quello recentemente descrittoCibiobacterclade.In questo gruppo chiuso sono stati identificati cinque presunti fagi, che vanno da 8,5 a 65,9 kb.
Figura 6. Diagramma Circos dei genomi chiusi di P.copri e Cibiobacter sp.
Riferimento
Moss, EL, Maghini, DG e Bhatt, AS (2020).Genomi batterici completi e chiusi da microbiomi utilizzando il sequenziamento dei nanopori.Biotecnologie naturali,38(6), 701-707.
Tecnologia e punti salienti mira a condividere le più recenti applicazioni di successo di diverse tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento in vari ambiti di ricerca, nonché idee brillanti nella progettazione sperimentale e nel data mining.
Orario di pubblicazione: 07 gennaio 2022