RESEQUENSIONAMENTO DELL'INTERO GENOMA
Il monitoraggio genomico di SARS-CoV-2 scopre una variante di delezione Nsp1 che modula la risposta dell'interferone di tipo I
Nanoporo |Illumina |Risequenziamento dell'intero genoma |metagenomica |Sequenza RNA |Sanger
Biomarker Technologies ha fornito supporto tecnico sul sequenziamento dei campioni in questo studio.
Punti salienti
1.Il sequenziamento del genoma del SARS-CoV-2 e l'analisi filognetica identificano 35 mutazioni ricorrenti tra cui 31 SNP e 4 Indel.
2.L'associazione con 117 fenotipi clinici rivela potenzialità
importanti mutazioni.
∆500-532 nella regione codificante Nsp1 è correlato alla viralità inferiore
3.carico e IFN-β sierico.
4.Gli isolati virali con mutazione ∆500-532 inducono un IFN-I inferiore
risposta nelle cellule infette.
Design sperimentale
Risultati
1. Sorveglianza epidemiologica e genomica del COVID-19
I dati clinici sono stati raccolti nella provincia del Sichuan, in Cina, durante il periodo dell'epidemia dal 22 gennaio 2020 al 20 febbraio 2020. Un totale di 538 casi COVID-19 sono stati confermati dai test qPCR nel Sichuan, il 28,8% dei quali proveniva dalla provincia capitale.I casi confermati nel Sichuan sono aumentati in modo esponenziale, con un picco il 30 gennaio.Inoltre, i dati supportano il fatto che il distanziamento sociale può essere un fattore chiave nella prevenzione della diffusione del virus.
Figura 1. Studio epidemiologico sul COVID-19 nella provincia del Sichuan, in Cina
2. Costruzione del genoma SARS-CoV-2 e identificazione delle varianti
Con l'amplificazione PCR multiplex seguita dal sequenziamento dei nanopori, sono stati generati un totale di 310 genomi quasi o parzialmente completi di 248 pazienti con ca.80% dei genomi coperti da 10 letture (profondità media: 0,39 milioni di letture per campione).
Figura 2. Frequenza di ciascuna variante nella coorte del Sichuan
Un totale di 104 SNP e 18 Indel sono stati identificati dai genomi SARS-CoV-2, in cui 31 SNP e 4 Indel sono stati identificati come varianti genetiche ricorrenti.Confrontandoli con 169 campioni di Wuhan e con 81.391 sequenze di genoma pubblico di alta qualità in GISAID, 29 delle 35 varianti trovate presentavano in altri continenti.In particolare, quattro varianti, tra cui ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 e T13243C, sono presenti solo in Sichuan e Wuhan e assenti nei dati GISAID, indicando che era molto probabile che queste varianti fossero importate da Wuhan, che soddisfano i requisiti registri di viaggio dei pazienti.
L'analisi evolutiva con il metodo della massima verosimiglianza (ML) e gli approcci dell'orologio molecolare bayesiano è stata elaborata su 88 nuovi virus provenienti dal Sichuan e su 250 genomi curati provenienti da altre regioni.Genomi con ∆500-532 (delezioni nella regione codificante Nsp1) sono stati trovati distribuiti scarsamente nell'albero filogenetico.L'analisi dell'aplotipo sulle varianti Nsp1 ne ha identificate 5 provenienti da più città.Questi risultati suggeriscono che il ∆500-532 si è verificato in più città e potrebbe essere importato più volte da Wuhan.
Figura 2. Varianti genetiche ricorrenti e analisi filogenetica nei genomi SARS-CoV-2
3. Associazione di varianti genetiche ricorrenti con implicazioni cliniche
117 fenotipi clinici sono stati associati alla gravità del COVID-19, di cui 19 fenotipi correlati alla gravità sono stati classificati in tratti gravi e non gravi.La relazione tra questi tratti e 35 varianti genetiche ricorrenti è stata visualizzata nella mappa termica bi-cluster.Un'analisi di arricchimento classificata simile a GSEA ha mostrato che ∆500-532 è correlato negativamente con la VES, l'IFN-β sierico e la conta delle cellule T CD3+CD8+ nel sangue.Inoltre, i test qPCR hanno dimostrato che i pazienti infetti da virus che ospitavano ∆500-532 avevano il valore Ct più alto, cioè la carica virale più bassa.
Figura 3. Associazioni di 35 varianti genetiche ricorrenti con fenotipi clinici
4. Validazione sui fenotipi clinici associati a mutazioni virali
Per comprendere gli effetti di ∆500-532 sulle funzioni di Nsp1, le cellule HEK239T sono state trasfettate con plasmidi che esprimono forme intere, WT Nsp1 e mutanti con delezioni.I profili del trascrittoma di ciascuna cellula HEK239T trattata sono stati elaborati per l'analisi PCA, dimostrando che i mutanti di delezione si raggruppavano relativamente più vicini ed erano significativamente diversi da WT Nsp1.I geni che erano significativamente sovraregolati nei mutanti erano principalmente arricchiti nel "processo biosintetico/metabolico del peptide", nella "biogenesi del complesso ribonucleoproteico", nel "targeting delle proteine sulla membrana/ER", ecc. Inoltre, due delezioni hanno mostrato un modello di espressione distinto dal WT.
Figura 4. Analisi del trascrittoma su cellule HEK239T trasfettate da WT Nsp1 e quelle con delezioni
Anche gli effetti delle delezioni sulla risposta dell'IFN-1 sono stati testati in uno studio sulla sovraespressione.È stato dimostrato che tutte le delezioni testate riducono la risposta dell'IFN-1 nelle cellule HEK239T e A549 trasfettate sia a livello del trascrittoma che a livello proteico.È interessante notare che i geni significativamente sottoregolati nelle delezioni sono stati arricchiti in “risposta di difesa al virus”, “replicazione del genoma virale”, “regolazione della trascrizione mediante RNA polimerasi II” e “risposta all’interferone di tipo I”.
Figura 5. Downregulation delle vie di segnalazione dell'interferone nel mutante ∆500-532
In questo studio, l’impatto di queste delezioni sul virus è stato ulteriormente confermato da studi sulle infezioni virali.I virus con determinati mutanti sono stati isolati da campioni clinici e infettati con cellule Calu-3.I risultati dettagliati sullo studio sulle infezioni virali possono essere letti nel documento.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Riferimento
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Il monitoraggio genomico di SARS-CoV-2 scopre una variante di delezione di Nsp1 che modula la risposta dell’interferone di tipo I[J].Ospite cellulare e microbo, 2021.
Novità e punti salienti mira a condividere gli ultimi casi di successo con Biomarker Technologies, catturando nuovi risultati scientifici e tecniche importanti applicate durante lo studio.
Orario di pubblicazione: 06 gennaio 2022