Sequenziamento dell'mRNA a lunghezza intera -PacBio
Vantaggi del servizio
● Lettura diretta della molecola di cDNA a lunghezza intera dall'estremità 3' all'estremità 5'
● Risoluzione del livello isoforma nella struttura della sequenza
● Trascrizioni con elevata precisione e integrità
● Altamente compatibile con varie specie
● Ampia capacità di sequenziamento con 4 piattaforme di sequenziamento PacBio Sequel II equipaggiate
● Elevata esperienza con oltre 700 progetti di sequenziamento dell'RNA basati su Pacbio
● Consegna dei risultati basata su BMKCloud: data mining personalizzato disponibile sulla piattaforma.
● Servizi post-vendita validi per 3 mesi dal completamento del progetto
Specifiche del servizio
Piattaforma: PacBio Sequel II
Libreria di sequenziamento: libreria di mRNA arricchita con Poly A
Resa dati consigliata: 20 Gb/campione (a seconda della specie)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: trascrizioni non chimeriche integrali
Analisi bioinformatiche
● Elaborazione dei dati grezzi
● Identificazione della trascrizione
● Struttura della sequenza
● Quantificazione delle espressioni
● Annotazione della funzione
Requisiti e consegna del campione
Requisiti del campione:
Nucleotidi:
| Concentrazione (ng/μl) | Quantità (μg) | Purezza | Integrità |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | DE260/280=1,7-2,5 DE260/230=0,5-2,5 Contaminazione limitata o assente di proteine o DNA mostrata sul gel. | Per gli impianti: RIN≥7,5; Per gli animali: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; elevazione della linea di base limitata o assente |
Tessuto: Peso (asciutto):≥1 g
*Per tessuti di peso inferiore a 5 mg, si consiglia di inviare campioni di tessuto congelati istantaneamente (in azoto liquido).
Sospensione cellulare:Conteggio delle cellule = 3×106-1×107
*Si consiglia di spedire il lisato cellulare congelato.Nel caso in cui la cella conteggi inferiore a 5×105, si consiglia il congelamento rapido in azoto liquido, preferibile per la microestrazione.
Campioni di sangue:Volume≥1 ml
Microrganismo:Massa ≥ 1 g
Consegna del campione consigliata
Contenitore:
Provetta da centrifuga da 2 ml (la carta stagnola non è consigliata)
Etichettatura del campione: Gruppo+replica, ad esempio A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Spedizione:
1. Ghiaccio secco: i campioni devono essere confezionati in sacchetti e sepolti nel ghiaccio secco.
2. Provette RNAstable: i campioni di RNA possono essere essiccati in provette di stabilizzazione dell'RNA (ad esempio RNAstable®) e spediti a temperatura ambiente.
Flusso di lavoro del servizio
Progettazione dell'esperimento
Consegna del campione
Estrazione dell'RNA
Costruzione della biblioteca
Sequenziamento
Analisi dei dati
Servizi post-vendita
1.Distribuzione della lunghezza FLNC
La lunghezza della lettura non chimerica a lunghezza intera (FLNC) indica la lunghezza del cDNA nella costruzione della libreria.La distribuzione della lunghezza FLNC è un indicatore cruciale nella valutazione della qualità della costruzione della biblioteca.
FLNC legge la distribuzione della lunghezza
2.Distribuzione completa della lunghezza della regione ORF
Utilizziamo TransDecoder per prevedere le regioni codificanti delle proteine e le corrispondenti sequenze di amminoacidi per generare set unigeni, che contengono informazioni complete sulla trascrizione non ridondanti in tutti i campioni.
Distribuzione completa della lunghezza della regione ORF
3. Analisi dell'arricchimento del percorso KEGG
Le trascrizioni differenzialmente espresse (DET) possono essere identificate allineando i dati di sequenziamento dell'RNA basati su NGS su set di trascrizioni a lunghezza intera generati dai dati di sequenziamento PacBio.Questi DET possono essere ulteriormente elaborati per varie analisi funzionali, ad esempio l'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG.
Arricchimento del percorso DET KEGG -Dot plot
Caso BMK
Le dinamiche di sviluppo del trascrittoma della radice di Populus
Pubblicato: Giornale delle biotecnologie vegetali, 2019
Strategia di sequenziamento:
Raccolta campioni:regioni dello stelo: apice, primo internodo (IN1), secondo internodo (IN2), terzo internodo (IN3), internodo (IN4) e internodo (IN5) da Nanlin895
Sequenza NGS:L'RNA di 15 individui è stato raggruppato come un unico campione biologico.Tre repliche biologiche di ciascun punto sono state elaborate per la sequenza NGS
Sequenza TGS:Le regioni staminali sono state divise in tre regioni, ovvero apice, IN1-IN3 e IN4-IN5.Ciascuna regione è stata elaborata per il sequenziamento PacBio con quattro tipi di librerie: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb e 3-10 kb.
Risultati chiave
1. Sono state identificate un totale di 87150 trascrizioni integrali, in cui sono state identificate 2081 nuove isoforme e 62058 nuove isoforme di splicing alternative.
Sono stati identificati 2.1187 lncRNA e 356 geni di fusione.
3. Dalla crescita primaria alla crescita secondaria, sono state identificate 15838 trascrizioni differenzialmente espresse da 995 geni differenzialmente espressi.In tutti i DEG, 1216 erano fattori di trascrizione, la maggior parte dei quali non è stata ancora segnalata.
L'analisi dell'arricchimento 4.GO ha rivelato l'importanza della divisione cellulare e del processo di ossidoriduzione nella crescita primaria e secondaria.
Eventi di splicing alternativo e diverse isoforme
Analisi WGCNA sui fattori di trascrizione
Riferimento
Chao Q, Gao ZF, Zhang D et al.Le dinamiche di sviluppo del trascrittoma della radice di Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
