METAGENOMI
Genom bakteri lengkap dan tertutup dari mikrobioma menggunakan sekuensing nanopore
Urutan Nanopori |Metagenomik |MAG |Sirkularisasi genom bakteri |Mikrobiota usus
Highlight
1. Metode baru untuk mengekstraksi fragmen DNA yang panjang disajikan dalam penelitian ini, yang menghasilkan ekstraksi mikrogram DNA HMW murni yang sesuai untuk pengurutan baca panjang dari 300 mg tinja
2. Alur kerja perakitan, Bubut, diperkenalkan dalam penelitian ini, di mana MAG dirakit dengan pembacaan panjang dan dikoreksi dengan pembacaan pendek.
3.Bubut dievaluasi dengan campuran tiruan.7 dari 12 bakteri berhasil dirangkai menjadi satu contig dan 3 bakteri berhasil dirangkai menjadi empat contig atau lebih sedikit.
4.Bubut selanjutnya diterapkan pada sampel tinja, yang menghasilkan 20 genom yang diedarkan, termasuk Prevotella copri dan kandidat Cibiobacter sp., yang dikenal kaya akan unsur genetik seluler.
Prestasi Utama
Protokol ekstraksi untuk DNA HWM
Studi metagenomik usus berbasis sekuensing yang telah lama dibaca telah lama mengalami kesulitan dalam mengekstraksi DNA dengan berat molekul tinggi (HMW) dari tinja.Dalam penelitian ini, protokol ekstraksi berbasis enzim diperkenalkan untuk menghindari pemotongan ekstensif akibat pemukulan manik dalam metode tradisional.Seperti yang ditunjukkan pada gambar berikut, sampel pertama-tama diolah dengan campuran enzim, termasuk enzim litik, MetaPolyzyme, dll. untuk mendegradasi dinding sel.DNA yang dilepaskan diekstraksi dengan sistem Fenol-kloroform, diikuti dengan pencernaan Proteinase K dan RNase A, pemurnian berbasis kolom dan pemilihan ukuran SPRI.Metode ini berhasil menghasilkan mikrogram DNA HMW dari tinja sepanjang 300 m, yang memenuhi persyaratan pengurutan baca panjang baik dari segi kualitas maupun kuantitas.
Gambar 1. Skema ekstraksi DNA HWM
Skema aliran Bubut
Seperti dijelaskan pada gambar berikut, Bubut berisi proses proses pemanggilan dasar mentah menggunakan Guppy.Dua rakitan yang sudah lama dibaca kemudian diproduksi oleh Flye dan Canu secara terpisah diikuti dengan deteksi dan penghapusan kesalahan rakitan.Kedua sub-rakitan digabungkan dengan quickmerge.Setelah penggabungan, majelis besar di tingkat megabase kemudian diperiksa untuk diedarkan.Selanjutnya, penyempurnaan konsensus pada majelis ini diproses dengan pembacaan singkat.Genom bakteri rakitan akhir diproses untuk deteksi dan penghapusan kesalahan perakitan akhir.
Gambar 2. Skema alur perakitan Mesin Bubut
Evaluasi Mesin Bubut dengan campuran bakteri tiruan
Campuran standar ATCC 12-spesies yang terdiri dari bakteri Gram-positif dan Gram-negatif digunakan untuk mengevaluasi kinerja platform pengurutan nanopori dan Bubut dalam perakitan MAG.Sebanyak 30,3 Gb data dihasilkan oleh platform nanopore dengan N50 sebesar 5,9 kb.Mesin bubut secara signifikan meningkatkan perakitan N50 menjadi 1,6 hingga 4 kali lipat dibandingkan dengan alat perakitan yang sudah lama dibaca dan 2 hingga 9 kali lipat dibandingkan dengan alat perakitan hybrid.Dari 12 genom bakteri, tujuh dirangkai menjadi satu kesatuan (Gambar 3. Circos dengan titik hitam).Tiga lagi dirangkai menjadi empat atau lebih sedikit contig, di mana perakitan paling tidak lengkap berisi 83% genom dalam satu contig.
Gambar 3. Kumpulan genom dalam campuran bakteri 12 spesies tertentu
Penerapan Mesin Bubut pada sampel tinja
Metode ini selanjutnya diterapkan pada sampel tinja manusia untuk membandingkan identifikasi organisme dan kedekatan perakitan dengan metode yang ada, analisis berbasis read-cloud dan short-read.Dari tiga sampel yang terlibat, ekstraksi berbasis enzim baru menghasilkan setidaknya 1 μg per 300 mg massa masukan.Urutan nanopore dari DNA HMW ini menghasilkan pembacaan panjang dengan N50 masing-masing sebesar 4,7 kb, 3.0kb dan 3.0kb.Khususnya, metode saat ini menunjukkan potensi besar dalam deteksi mikroba dibandingkan dengan metode yang ada.Keanekaragaman alfa pada tingkat spesies yang relatif lebih tinggi ditunjukkan di sini dibandingkan dengan short-read dan read-cloud.Selain itu, semua genera dari analisis singkat, bahkan organisme Gram-positif yang biasanya resisten terhadap lisis, diperoleh dengan metode ini.
Gambar 4. Keanekaragaman alfa dan komponen taksonomi ditentukan dengan metode Nanopore, short-read, dan read-cloud
Mesin bubut menghasilkan N50 perakitan utuh yang jauh lebih lama dibandingkan perakitan baca pendek dan baca cloud, meskipun input data mentahnya tiga hingga enam kali lipat lebih rendah.Draf genom diproduksi dengan cara contig binning, di mana draf tersebut diklasifikasikan menjadi “berkualitas tinggi” atau “parsial” berdasarkan kelengkapan, kontaminasi, salinan gen inti tunggal, dll. Rakitan yang sudah lama dibaca menunjukkan kedekatan yang jauh lebih tinggi dengan biaya lebih rendah dibandingkan untuk membaca singkat dan membaca-cloud.
Gambar 5. Kedekatan perakitan per organisme dari masing-masing metode
Selain itu, pendekatan perakitan saat ini mampu menghasilkan genom sirkular yang tertutup.Dalam sampel tinja, delapan genom single-contig berkualitas tinggi dikumpulkan dan lima di antaranya mencapai sirkulasi yang tepat.Pendekatan yang telah lama dibaca juga menunjukkan kapasitas yang mengesankan dalam menyelesaikan elemen berulang dalam genom.DiedarkanP. koprigenom dihasilkan oleh pendekatan ini, yang diketahui mengandung pengulangan urutan tingkat tinggi.Perakitan terbaik genom ini melalui short-read dan read-cloud tidak pernah melebihi N50 sebesar 130 kb, bahkan dengan kedalaman cakupan 4800X.Elemen dengan jumlah salinan yang tinggi ini sepenuhnya diselesaikan dengan pendekatan baca panjang, yang sering kali ditemukan pada titik puncak rakitan baca pendek atau baca cloud.Genom tertutup lainnya dilaporkan dalam penelitian ini, yang diyakini merupakan anggota dari genom yang baru saja dideskripsikanCibiobakterkelas.Lima fag diduga diidentifikasi dalam perakitan tertutup ini, berkisar antara 8,5 hingga 65,9 kb.
Gambar 6. Diagram sirko genom tertutup P.copri dan Cibiobacter sp.
Referensi
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Genom bakteri lengkap dan tertutup dari mikrobioma menggunakan sekuensing nanopore.Bioteknologi alam,38(6), 701-707.
Teknologi dan Sorotan bertujuan untuk berbagi penerapan sukses terkini dari berbagai teknologi pengurutan throughput tinggi di berbagai arena penelitian serta ide-ide cemerlang dalam desain eksperimental dan penambangan data.
Waktu posting: 07 Januari 2022