GENOMI MANUSIA
genetika alam
Urutan baca yang panjang mengidentifikasi ekspansi berulang GGC di NOTCH2NLC yang terkait dengan penyakit inklusi intranuklear neuron
pengurutan ulang ONT |Menerangi |Urutan exome keseluruhan |Urutan bertarget CRISPR-Cas9 ONT |RNA-seq |Panggilan metilasi ONT 5mC
Highlight
1.Dengan analisis Linkage pada keluarga besar NIID, dua wilayah terkait diidentifikasi.
2. Sekuensing baca panjang berbasis ONT dan sekuensing ONT pengayaan yang dimediasi Cas-9 menemukan penyebab genetik potensial NIID, ekspansi berulang GGC di 5′ UTR dari NOTCH2NLC.Studi ini melaporkan ekspansi berulang pada gen spesifik manusia untuk pertama kalinya yang berevolusi melalui duplikasi segmental.
3. Urutan RNA mengungkapkan transkrip antisense abnormal di awal atau di dalam wilayah ekspansi berulang GGC di NOTCH2NLC.
Latar belakang
Npenyakit inklusi intranuklear euronal (NIID) adalah penyakit neurodegeneratif progresif dan fatal, yang ditandai dengan adanya inklusi intranuklear hialin eosinofilik di sistem saraf pusat dan perifer.Manifestasi klinisnya yang sangat bervariasi menimbulkan kesulitan besar dalam diagnosis sampai dilakukannya biopsi kulit.Namun, metode berbasis histopatologi masih mengalami kesalahan diagnosis, sehingga memerlukan pemahaman genetik tentang NIID.
Prestasi
Analisis Keterkaitan
Spengurutan seluruh genom (WGS) dan pengurutan exome keseluruhan (WES) berdasarkan sekuensing baca pendek dilakukan pada keluarga besar NIID (13 anggota yang terkena dampak dan 7 anggota yang tidak terpengaruh).Analisis keterkaitan pada SNP yang diekstraksi dari data ini mengungkapkan hanya dua wilayah yang terhubung: wilayah 3,5 Mb pada 1p36.31-p36.22 (LOD maksimum=2.32) dan wilayah 58.1 Mb pada 1p22.1-q21.3 (LOD maksimum: 4.21 ).Namun, tidak ada SNP atau CNV patogen yang diidentifikasi di wilayah terkait ini.
GGC mengulangi ekspansi di NOTCH2NLC
Npengurutan berbasis anopore diproses pada 13 anggota yang terkena dampak dan 4 anggota yang tidak terkena dampak dari 8 keluarga (anggota yang terkena dampak lainnya diurutkan oleh platform pengurutan yang sudah lama dibaca Pacbio.).Data yang telah lama dibaca mengungkapkan ekspansi berulang GGC terkait penyakit dalam pemetaan gen 5′ UTR dari NOTCH2NLC ke wilayah terkait 58,1 Mb (Gambar 1).Perluasan berulang ini juga teridentifikasi pada 40 kasus NIID sporadis yang diuji dengan RP-PCR.
Cpengurutan target yang dimediasi as-9 pada platform nanopore digunakan untuk mencapai cakupan baca yang lebih tinggi pada pengulangan NOTCH2NLC (100 X-1,795 X).Urutan konsensus ini sangat sesuai dengan temuan sebelumnya mengenai ekspansi berulang GGC.Selain itu, pengulangan {(GGA)n (GGC)n}n diidentifikasi sebagai penanda genetik potensial untuk fenotip dominan kelemahan (Gambar 2).
Gambar 1. Ekspansi berulang terkait penyakit yang diidentifikasi pada ekson 1 isoform NOTCH2NLC.
Gambar 2. Urutan konsensus pengulangan NPTCH2NLC pada pasien NIID dengan (*) atau tanpa fenotip dominan kelemahan
NGen OTCH2NL adalah gen khusus manusia, yang diyakini memainkan peran penting dalam evolusi otak manusia dan penyakit neurologis.Namun, tiga gen terkait NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB, dan NOTCH2NLC) dengan identitas urutan >99,1% tidak terselesaikan hingga perakitan genom manusia terbaru.Urutan bebas sintesis dan pembacaan panjang pada platform nanopore telah menunjukkan keuntungan penting dalam menyelesaikan wilayah dengan kesamaan tinggi dan pengulangan (GGC)n dengan 100% kaya GC.
GGC mengulangi ekspansi di NOTCH2NLC
Tpengurutan ranscriptome diproses pada 2 anggota yang terpengaruh dan 2 anggota yang tidak terpengaruh.Kedalaman baca yang dinormalisasi dihitung pada untaian sense dan antisense di hulu ekson pertama paralog NOTCH2NL.Transkrip anti-indra yang abnormal hanya ditemukan pada kasus yang terkena dampak, yang berada di awal atau di dalam wilayah ekspansi berulang (Puncak ungu di F1-14 dan F1-16 pada Gambar 3.).Selain itu, 54 DEG diidentifikasi dan semuanya diperkaya dalam istilah GO dan MPO yang terkait dengan fungsi saraf.
Gambar 3. Kedalaman baca yang dinormalisasi pada hulu ekson pertama NOTCH2NLC dalam kasus yang tidak terpengaruh (di atas) dan terpengaruh (di bawah).
Teknologi
Teknologi Nanopore Oxford (ONT)
Nsekuensing anopori membedakan dirinya dari platform sekuensing lainnya, karena nukleotida dibaca secara langsung tanpa proses sintesis DNA.Saat DNA untai tunggal melewati pori protein berukuran nano (nanopori), nukleotida yang berbeda menghasilkan arus ionik yang berbeda, yang dapat ditangkap dan ditransfer ke dalam rangkaian basa.Platform pengurutan ONT sendiri tidak menunjukkan batasan teknis yang jelas mengenai lamanya pembacaan DNA.Oleh karena itu, pembacaan ultra-panjang (ULR) tersedia untuk perakitan genom berkualitas tinggi.Selain itu, pembacaan yang sangat panjang ini, yang cukup panjang untuk melewati fitur rangkaian kompleks atau variasi struktural, membantu mengatasi keterbatasan rangkaian bacaan pendek di sini.
Urutan nanopori
Identifikasi variasi struktur (SV).
Ssekuensing bebas sintesis sebagian besar mempertahankan informasi metilasi DNA pada templat.A, T, C, dan G yang termetilasi menghasilkan arus ionik yang berbeda dari arus ionik yang tidak termetilasi, yang dapat dibaca langsung oleh platform.Urutan nanopore memberdayakan pembuatan profil seluruh genom 5mC dan 6mA pada resolusi nukleotida tunggal.
Referensi
Jun Sone, dkk.Al.Urutan baca yang panjang mengidentifikasi ekspansi berulang GGC di NOTCH2NLC yang terkait dengan penyakit inklusi intranuklear neuron.Genetika Alam (2019)
Teknologi dan Sorotan bertujuan untuk berbagi penerapan sukses terkini dari berbagai teknologi pengurutan throughput tinggi di berbagai arena penelitian serta ide-ide cemerlang dalam desain eksperimental dan penambangan data.
Waktu posting: 06 Januari 2022