PENYEDIAAN ULANG GENOME SELURUH
Pemantauan genomik SARS-CoV-2 mengungkap varian penghapusan Nsp1 yang memodulasi respons interferon tipe I
Nanopori |Menerangi |Pengurutan ulang seluruh genom |metagenomik |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies memberikan dukungan teknis pada pengurutan sampel dalam penelitian ini.
Highlight
1. Urutan genom SARS-CoV-2 dan analisis filognetik mengidentifikasi 35 mutasi berulang termasuk 31 SNP dan 4 Indel.
2. Asosiasi dengan 117 fenotip klinis berpotensi terungkap
mutasi penting.
∆500-532 di wilayah pengkodean Nsp1 berkorelasi dengan virus yang lebih rendah
3.load dan serum IFN-β.
4. Isolat virus dengan mutasi ∆500-532 menginduksi IFN-I yang lebih rendah
respons sel yang terinfeksi.
Desain eksperimental
Prestasi
1. Surveilans epidemiologi dan genomik COVID-19
Data klinis dikumpulkan di provinsi Sichuan, Tiongkok selama periode wabah mulai 22 Januari 2020 hingga 20 Februari 2020. Sebanyak 538 kasus COVID-19 terkonfirmasi melalui tes qPCR di Sichuan, 28,8% di antaranya berasal dari provinsi tersebut. modal.Kasus terkonfirmasi di Sichuan meningkat secara eksponensial, dan mencapai puncaknya pada tanggal 30 Januari.Selain itu, data mendukung bahwa penjarakan sosial dapat menjadi faktor kunci dalam mencegah penyebaran virus.
Gambar 1. Studi epidemiologi COVID-19 di provinsi Sichuan, Tiongkok
2. Konstruksi genom SARS-CoV-2 dan identifikasi varian
Dengan amplifikasi PCR multipleks diikuti dengan pengurutan nanopore, total 310 genom hampir atau sebagian lengkap dari 248 pasien dihasilkan dengan sekitar.80% genom tercakup dalam 10 pembacaan (Kedalaman rata-rata: 0,39 juta pembacaan per sampel).
Gambar 2. Frekuensi setiap varian pada kelompok Sichuan
Sebanyak 104 SNP dan 18 Indel teridentifikasi dari genom SARS-CoV-2, dimana 31 SNP dan 4 Indel teridentifikasi sebagai varian genetik berulang.Dengan membandingkannya dengan 169 sampel dari Wuhan dan dengan 81.391 rangkaian genom publik berkualitas tinggi di GISAID, 29 dari 35 varian yang ditemukan ditemukan di benua lain.Khususnya, empat varian termasuk ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 dan T13243C, hanya ditemukan di Sichuan dan Wuhan dan tidak ada dalam data GISAID, yang menunjukkan bahwa varian-varian ini kemungkinan besar diimpor dari Wuhan, yang memenuhi kriteria catatan perjalanan pasien.
Analisis evolusi dengan metode kemungkinan maksimum (ML) dan pendekatan jam molekuler Bayesian diproses pada 88 virus baru dari Sichuan dan 250 genom hasil kurasi dari wilayah lain.Genom dengan ∆500-532 (Penghapusan di wilayah pengkodean Nsp1) ditemukan tersebar jarang di pohon filogenetik.Analisis haplotype pada varian Nsp1 mengidentifikasi 5 varian di antaranya berasal dari berbagai kota.Hasil ini menunjukkan bahwa ∆500-532 terjadi di banyak kota dan mungkin diimpor beberapa kali dari Wuhan.
Gambar 2. Varian genetik berulang dan analisis filogenetik pada genom SARS-CoV-2
3. Asosiasi varian genetik berulang dengan implikasi klinis
117 fenotipe klinis dikaitkan dengan tingkat keparahan COVID-19, di mana 19 fenotipe terkait tingkat keparahan diklasifikasikan menjadi sifat parah dan tidak parah.Hubungan antara sifat-sifat ini dan 35 varian genetik berulang divisualisasikan dalam peta panas bi-cluster.Analisis pengayaan peringkat seperti GSEA menunjukkan bahwa ∆500-532 berkorelasi negatif dengan ESR, serum IFN-β dan jumlah sel T CD3+CD8+ dalam darah.Selain itu, tes qPCR menunjukkan bahwa pasien yang terinfeksi virus yang mengandung ∆500-532 memiliki nilai Ct tertinggi, yaitu viral load terendah.
Gambar 3. Asosiasi 35 varian genetik berulang dengan fenotipe klinis
4. Validasi fenotip klinis terkait mutasi virus
Untuk memahami pengaruh ∆500-532 pada fungsi Nsp1, sel HEK239T ditransfeksi dengan plasmid yang mengekspresikan bentuk penuh, WT Nsp1 dan bentuk mutan dengan penghapusan.Profil transkriptome dari masing-masing sel HEK239T yang dirawat diproses untuk analisis PCA, menunjukkan bahwa penghapusan mutan berkerumun relatif lebih dekat dan berbeda secara signifikan dari WT Nsp1.Gen-gen yang diregulasi secara signifikan dalam mutan terutama diperkaya dalam “proses biosintetik/metabolik peptida”, “biogenesis kompleks ribonukleoprotein”, “penargetan protein ke membran/ER”, dll. Selain itu, dua penghapusan menunjukkan pola ekspresi yang berbeda dari WT.
Gambar 4. Analisis transkriptome pada sel HEK239T yang ditransfeksi oleh WT Nsp1 dan dengan penghapusan
Pengaruh penghapusan terhadap respons IFN-1 juga diuji dalam studi yang diekspresikan secara berlebihan.Semua penghapusan yang diuji terbukti mengurangi respons IFN-1 pada sel HEK239T dan A549 yang ditransfusikan pada tingkat transkriptome dan tingkat protein.Menariknya, gen yang mengalami penurunan regulasi secara signifikan dalam penghapusan diperkaya dalam “respon pertahanan terhadap virus”, “replikasi genom virus”, “regulasi transkripsi oleh RNA polimerase II” dan “respons terhadap interferon tipe I”.
Gambar 5. Penurunan regulasi jalur pensinyalan interferon pada mutan ∆500-532
Dalam penelitian ini, dampak penghapusan ini terhadap virus dikonfirmasi lebih lanjut melalui penelitian infeksi virus.Virus dengan mutan tertentu diisolasi dari sampel klinis dan diinfeksi ke sel Calu-3.Hasil rinci studi infeksi virus dapat dibaca di makalah.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referensi
Lin J, Tang C, Wei H, dkk.Pemantauan genom SARS-CoV-2 mengungkap varian penghapusan Nsp1 yang memodulasi respons interferon tipe I[J].Host sel & mikroba, 2021.
Berita dan Sorotan bertujuan untuk berbagi kasus-kasus sukses terbaru dengan Biomarker Technologies, menangkap pencapaian ilmiah baru serta teknik-teknik terkemuka yang diterapkan selama penelitian.
Waktu posting: 06 Januari 2022