ՄԵՏԱԳԵՆՈՄԻԿԱ
Ամբողջական, փակ բակտերիաների գենոմներ միկրոբիոմներից, օգտագործելով նանոպորների հաջորդականությունը
Nanopore Sequencing |Մետագենոմիկա |MAGs |Բակտերիալ գենոմի շրջանաձևացում |Աղիքային միկրոբիոտա
Առանձնահատկություններ
1. Այս հետազոտության մեջ ներկայացվել է ԴՆԹ-ի երկար բեկորների արդյունահանման նոր մեթոդ, որի արդյունքում ստացվել է մաքուր, HMW ԴՆԹ-ի միկրոգրամի արդյունահանում, որը հարմար է 300 մգ կղանքից երկար ընթերցվող հաջորդականության համար:
2. Այս ուսումնասիրության մեջ ներկայացվեց հավաքման աշխատանքային հոսք՝ խառատահաստոց, որտեղ MAG-ները հավաքվում էին երկար ընթերցմամբ և ուղղվում կարճ ընթերցմամբ:
3. Խառատահաստոցը գնահատվել է կեղծ խառնուրդով:12 բակտերիաներից 7-ը հաջողությամբ հավաքվել են մեկ կոնտիգիների մեջ, իսկ 3-ը՝ չորս կամ ավելի քիչ բակտերիաների:
4. Խառատահաստոցը հետագայում կիրառվել է կղանքի նմուշների վրա, որոնք առաջացրել են 20 շրջանաձև գենոմներ, ներառյալ Prevotella copri-ն և թեկնածու Cibiobacter sp., որոնք հայտնի էին շարժական գենետիկ տարրերով հարուստ լինելու համար։
Հիմնական ձեռքբերում
HWM ԴՆԹ-ի արդյունահանման արձանագրություն
Երկար ընթերցված հաջորդականության վրա հիմնված աղիքների մետագենոմիական հետազոտությունները երկար ժամանակ տուժել են կղանքից բարձր մոլեկուլային քաշի (HMW) ԴՆԹ-ի արդյունահանման կարծրությունից:Այս ուսումնասիրության մեջ ներդրվել է ֆերմենտի վրա հիմնված արդյունահանման արձանագրություն՝ ավանդական մեթոդներով ուլունքների ծեծի միջոցով լայնածավալ կտրումից խուսափելու համար:Ինչպես ցույց է տրված հետևյալ նկարում, նմուշները նախ մշակվել են ֆերմենտների կոկտեյլով, ներառյալ լիտիկ ֆերմենտը, մետապոլիզիմը և այլն՝ բջջային պատերը քայքայելու համար:Ազատված ԴՆԹ-ն արդյունահանվել է ֆենոլ-քլորոֆորմ համակարգով, որին հաջորդել է Proteinase K և RNase A մարսումը, սյունակի վրա հիմնված մաքրումը և SPRI-ի չափի ընտրությունը:Այս մեթոդին հաջողվել է 300 մ կղանքից ստանալ HMW ԴՆԹ-ի միկրոգրամներ, որը բավարարում է երկար ընթերցված հաջորդականության պահանջները թե՛ որակի, թե՛ քանակի առումով:
Նկար 1. HWM ԴՆԹ-ի արդյունահանման սխեման
Խառատահաստոցի հոսքի սխեմա
Ինչպես նկարագրված է ստորև բերված նկարում, խառատահաստոցը պարունակում է Guppy-ի օգտագործմամբ հումքային բազային կանչի գործընթացի առկա գործընթացը:Այնուհետև Flye-ը և Canu-ն առանձին-առանձին արտադրում են երկու երկար կարդացված հավաքույթներ, որին հաջորդում է սխալ հավաքման հայտնաբերումը և հեռացումը:Երկու ենթահավաքները միաձուլված են արագ միաձուլմամբ:Միաձուլվելուց հետո մեգաբազային մակարդակի խոշոր հավաքույթները ստուգվում են շրջանաձևացման համար:Հետագայում այս հավաքների վերաբերյալ կոնսենսուսի ճշգրտումը մշակվում է կարճ ընթերցմամբ:Վերջնական հավաքված բակտերիաների գենոմները մշակվում են վերջնական սխալ հավաքման հայտնաբերման և հեռացման համար:
Նկար 2. Խառատահաստոցների հավաքման սխեմայի հոսքը
Խառատահաստոցի գնահատում բակտերիաների կեղծ խառնուրդով
Ստանդարտ ATCC 12-տեսակ խառնուրդը, որը ներառում է ինչպես գրամ դրական, այնպես էլ գրամ-բացասական բակտերիաներ, օգտագործվել է նանոպորների հաջորդականացման հարթակի և խառատահաստոցի աշխատանքը MAG հավաքման մեջ գնահատելու համար:Ընդհանուր 30,3 Գբ տվյալներ են ստեղծվել 5,9 կբ հզորությամբ nanopore հարթակով N50-ով:Խառատահաստոցը մեծապես բարելավեց N50 մոնտաժը 1,6-ից մինչև 4 անգամ՝ համեմատած երկար ընթերցված հավաքման գործիքների հետ և 2-ից 9 անգամ՝ համեմատած հիբրիդային հավաքման գործիքների հետ:12 բակտերիաների գենոմներից 7-ը հավաքվել են առանձին կոնտիգների մեջ (Նկար 3. Սև կետով կրկես):Եվս երեքը հավաքվել են չորս կամ ավելի քիչ կոնտիգների, որոնցում ամենաանավարտ համախմբումը պարունակում էր գենոմի 83%-ը մեկ կոնտիգի մեջ:
Գծապատկեր 3. Գենոմի հավաքներ սահմանված 12-տեսակ բակտերիաների խառնուրդում
Խառատահաստոցի կիրառում աթոռակի նմուշներում
Այս մեթոդը հետագայում կիրառվել է մարդու կղանքի նմուշների վրա՝ օրգանիզմի նույնականացման և հավաքման հարևանությունը գոյություն ունեցող մեթոդների, ընթերցանության ամպի և կարճ ընթերցման վրա հիմնված վերլուծության հետ համեմատելու համար:Ներգրավված երեք նմուշներից ֆերմենտի վրա հիմնված նոր արդյունահանումը բերեց առնվազն 1 մկգ 300 մգ մուտքային զանգվածի համար:Այս HMW ԴՆԹ-ի նանոպորների հաջորդականությունը ստեղծեց երկար ընթերցումներ N50-ով՝ համապատասխանաբար 4,7 կբ, 3,0 կբ և 3,0 կբ:Հատկանշական է, որ ներկա մեթոդը մեծ ներուժ է ցույց տվել մանրէների հայտնաբերման գործում՝ համեմատած գոյություն ունեցող մեթոդների հետ:Այստեղ ցուցադրվել է համեմատաբար ավելի բարձր տեսակների մակարդակի ալֆա բազմազանություն՝ համեմատած կարճ ընթերցման և կարդալու ամպի հետ:Ավելին, կարճ ընթերցված վերլուծությունից ստացված բոլոր սեռերը, նույնիսկ սովորաբար լիզի դիմացկուն գրամ-դրական օրգանիզմները, վերականգնվել են այս մեթոդով:
Նկար 4. Ալֆա բազմազանությունը և տաքսոնոմիկ բաղադրիչները որոշվում են Nanopore, կարճ ընթերցման և ընթերցման ամպի մեթոդներով
Խառատահաստոցը տվել է շատ ավելի երկար ամբողջական հավաքման N50, քան կարճ ընթերցման և կարդալու ամպի հավաքումը, չնայած հում տվյալների երեքից վեց անգամ ավելի ցածր մուտքագրմանը:Նախագծային գենոմները արտադրվել են անընդմեջ տեղադրման միջոցով, որի դեպքում նախագծերը դասակարգվել են «բարձրորակ» կամ «մասնակի»՝ հիմնվելով ամբողջականության, աղտոտվածության, մեկ օրինակով հիմնական գեների և այլնի վրա: կարճ կարդալ և կարդալ-ամպ:
Նկար 5. Յուրաքանչյուր մեթոդի յուրաքանչյուր օրգանիզմի հավաքման հարևանությունը
Ավելին, ներկա հավաքման մոտեցումը կարող է տալ փակ, շրջանաձև գենոմներ:Աթոռի նմուշներում հավաքվել են ութ բարձրորակ, միաձույլ գենոմներ, որոնցից հինգը հասել են հստակ շրջանաձևացման:Երկար ընթերցված մոտեցումը ցույց տվեց նաև տպավորիչ կարողություն գենոմներում կրկնվող տարրերը լուծելու գործում:ՇրջանաձևP. copriԳենոմը ստեղծվել է այս մոտեցմամբ, որը, ինչպես հայտնի է, պարունակում է հաջորդականության բարձր աստիճանի կրկնություն:Այս գենոմի լավագույն հավաքումը կարճ ընթերցման և ընթերցման ամպի միջոցով երբեք չի գերազանցել N50-ը՝ 130 կբ, նույնիսկ 4800X ծածկույթի խորությամբ:Պատճենների մեծ թվով այս տարրերը լիովին լուծվել են երկար ընթերցման մոտեցմամբ, որը հաճախ հայտնաբերվել է կարճ ընթերցման կամ կարդալու ամպի հավաքների բեկման կետերում:Մեկ այլ փակ գենոմ է հաղորդվել այս ուսումնասիրության մեջ, որը ենթադրվում էր, որ վերջերս նկարագրվածի անդամ էCibiobacterկլադ.Այս փակ հավաքույթում հայտնաբերվել է հինգ ենթադրյալ ֆագ՝ տատանվում է 8,5-ից մինչև 65,9 կբ:
Նկար 6. P.copri-ի և Cibiobacter sp-ի փակ գենոմների Circos դիագրամը:
Հղում
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020):Ամբողջական, փակ բակտերիաների գենոմներ միկրոբիոմներից, օգտագործելով նանոպորների հաջորդականությունը:Բնության կենսատեխնոլոգիա,38(6), 701-707 թթ.
Tech and Highlights նպատակ ունի կիսվել տարբեր հետազոտական ասպարեզներում տարբեր բարձր թողունակության հաջորդականության տեխնոլոգիաների վերջին հաջող կիրառմամբ, ինչպես նաև փորձարարական նախագծման և տվյալների արդյունահանման ոլորտում փայլուն գաղափարներով:
Հրապարակման ժամանակը՝ Հունվար-07-2022