ՄԱՐԴՈՒ ԳԵՆՈՄԻԿԱ
բնության գենետիկա
Երկար ընթերցված հաջորդականությունը բացահայտում է GGC կրկնվող ընդլայնումները NOTCH2NLC-ում՝ կապված նեյրոնային ներմիջուկային ներառման հիվանդության հետ
ONT resequencing |Illumina |Ամբողջ էքսոմի հաջորդականությունը |CRISPR-Cas9 ONT նպատակային հաջորդականություն |ՌՆԹ-հաջորդական |ONT 5mC մեթիլացման կանչ
Առանձնահատկություններ
1. NIID-ի մեծ ընտանիքի վրա կապակցման վերլուծության միջոցով բացահայտվեցին երկու կապակցված շրջաններ:
2.ONT-ի վրա հիմնված երկար ընթերցված հաջորդականությունը և Cas-9-ի միջնորդավորված հարստացումը ONT հաջորդականությունը հայտնաբերել են NIID, GGC կրկնվող ընդլայնումների պոտենցիալ գենետիկական պատճառ NOTCH2NLC-ի 5' UTR-ում:Այս ուսումնասիրությունն առաջին անգամ արձանագրել է մարդուն հատուկ գեների կրկնվող ընդլայնումներ, որոնք առաջացել են հատվածային կրկնօրինակումների միջոցով:
3.ՌՆԹ-ի հաջորդականությունը բացահայտեց աննորմալ հակազգայական տառադարձումներ սկզբում կամ ներսում GGC կրկնվող ընդլայնման շրջաններում NOTCH2NLC-ում:
Նախապատմություն
NԵվրոնալ ներմիջուկային ներառման հիվանդությունը (NIID) առաջադեմ և մահացու նեյրոդեգեներատիվ հիվանդություն է, որը բնութագրվում է կենտրոնական և ծայրամասային նյարդային համակարգերում էոզինոֆիլ հիալինային ներմիջուկային ինկլյուզիաների առկայությամբ:Նրա խիստ փոփոխական կլինիկական դրսևորումները մեծ դժվարություններ են առաջացնում ախտորոշման մեջ մինչև մաշկի բիոպսիայի ներդրումը:Այնուամենայնիվ, հիստոպաթոլոգիայի վրա հիմնված մեթոդները դեռևս տառապում են սխալ ախտորոշմամբ, ինչը պահանջում է NIID-ի գենետիկական ըմբռնում:
Ձեռքբերումներ
Կապի վերլուծություն
SԱմբողջ գենոմի հաջորդականությունը (WGS) և ամբողջ էկզոմի հաջորդականությունը (WES) կատարվել է NIID-ի մեծ ընտանիքի վրա (13 տուժած և 7 չազդված անդամներ):Այս տվյալներից արդյունահանված SNP-ների վրա կապի վերլուծությունը բացահայտեց միայն երկու կապակցված շրջան՝ 3.5 Մբ տարածք 1p36.31-p36.22 (առավելագույն LOD=2.32) և 58.1 Մբ տարածք 1p22.1-q21.3 (առավելագույն LOD՝ 4.21): ).Այնուամենայնիվ, այս կապակցված շրջաններում ախտածին SNP-ներ կամ CNV-ներ չեն հայտնաբերվել:
GGC-ի կրկնվող ընդարձակումները NOTCH2NLC-ում
Nanopore-ի վրա հիմնված հաջորդականությունը մշակվել է 13 ազդակիր և 4 չազդված անդամների վրա 8 ընտանիքներից (մեկ այլ ազդակիր անդամ հաջորդականացվել է Pacbio երկար ընթերցման հաջորդականության հարթակով):Երկար կարդացված տվյալները բացահայտեցին հիվանդության հետ կապված GGC կրկնվող ընդարձակումները NOTCH2NLC գենի քարտեզագրման 5′ UTR-ում մինչև 58,1 Մբ կապված տարածաշրջան (Նկար 1):Այս կրկնվող ընդլայնումները հայտնաբերվել են նաև RP-PCR-ով փորձարկված NIID-ի բոլոր 40 պատահական դեպքերում:
Cas-9-ի միջնորդավորված թիրախային հաջորդականությունը նանոպորային հարթակի վրա կիրառվել է NOTCH2NLC կրկնության վրա ավելի բարձր ընթերցման ծածկույթի հասնելու համար (100 X-1,795 X):Այս կոնսենսուսային հաջորդականությունները լավ համընկնում էին GGC կրկնվող ընդլայնումների վերաբերյալ նախորդ գտածոների հետ:Ավելին, {(GGA)n (GGC)n}n կրկնությունները հայտնաբերվել են որպես թուլության գերիշխող ֆենոտիպի պոտենցիալ գենետիկական մարկեր (Նկար 2):
Նկար 1. Հիվանդության հետ կապված կրկնվող ընդլայնումը բացահայտված է NOTCH2NLC իզոֆորմների էկզոն 1-ում:
Նկար 2. NPTCH2NLC-ի կոնսենսուսային հաջորդականությունները կրկնվում են NIID հիվանդների մոտ (*) կամ առանց թուլության գերիշխող ֆենոտիպով
NOTCH2NL գեները մարդուն հատուկ գեներ են, որոնք, ինչպես ենթադրվում է, կենսական դեր են խաղում մարդու ուղեղի էվոլյուցիայի և նյարդաբանական հիվանդությունների մեջ:Այնուամենայնիվ, երեք NOTCH2-ի հետ կապված գեներ (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB և NOTCH2NLC), որոնք ունեն >99,1% հաջորդականության նույնականացում, մինչև մարդու գենոմի վերջին հավաքումը չլուծվեցին:Սինթեզից զերծ և երկար ընթերցված հաջորդականությունը նանոփորիկ հարթակի վրա ցույց են տվել զգալի առավելություններ՝ 100% GC-ով հարուստ բարձր նմանությունների և (GGC)n կրկնությունների շրջանները լուծելու հարցում:
GGC-ի կրկնվող ընդարձակումները NOTCH2NLC-ում
Transcriptome sequencing-ը մշակվել է 2 ախտահարված և 2 չազդված անդամների վրա:Նորմալացված ընթերցման խորությունը հաշվարկվել է NOTCH2NL պարալոգների առաջին էկզոնների վերևում գտնվող զգայական և հակազգայական շղթաների վրա:Աննորմալ հակազգայական տառադարձումներ հայտնաբերվել են միայն ախտահարված դեպքերում, որոնք գտնվում են սկզբում կամ կրկնվող ընդարձակման շրջանում (մանուշակագույն գագաթները F1-14-ում և F1-16-ում՝ Նկար 3-ում):Բացի այդ, հայտնաբերվել են 54 DEG-ներ, և բոլորը հարստացվել են GO և MPO տերմիններով՝ կապված նեյրոնների գործառույթների հետ:
Նկար 3. Նորմալացված ընթերցման խորությունը NOTCH2NLC-ի առաջին էկզոնի վերևում՝ չազդված (վերևում) և տուժած (ներքևում) դեպքերում:
Տեխնոլոգիա
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
NԱնոպորային հաջորդականությունը տարբերվում է հաջորդականության այլ հարթակներից, քանի որ նուկլեոտիդներն ուղղակիորեն ընթերցվում են առանց ԴՆԹ-ի սինթեզի գործընթացի:Երբ մեկ շղթայական ԴՆԹ անցնում է նանո չափի սպիտակուցային ծակոտիով (նանոփոր), տարբեր նուկլեոտիդներ առաջացնում են տարբեր իոնային հոսանքներ, որոնք կարող են գրավվել և փոխանցվել հիմքերի հաջորդականության:ONT հաջորդականության հարթակը ինքնին չի ցուցադրում ակնհայտ տեխնիկական սահմանափակում ԴՆԹ-ի ընթերցման երկարության վրա:Հետևաբար, Ուլտրա երկար ընթերցումները (ULR) հասանելի են գենոմի բարձր որակի հավաքման համար:Ավելին, այս չափազանց երկար ընթերցումները, որոնք բավական երկար են՝ հատելու բարդ հաջորդականության հատկանիշները կամ կառուցվածքային տատանումները, օգնում են հաղթահարել այստեղ կարճ ընթերցման հաջորդականության սահմանափակումները:
Nanopore հաջորդականություն
Կառուցվածքային տատանումների (SV) նույնականացում
Sսինթեզից զերծ հաջորդականությունը հիմնականում պահպանեց ԴՆԹ-ի մեթիլացման տեղեկատվությունը կաղապարի վրա:Մեթիլացված A, T, C և G-ն առաջացնում են տարբեր իոնային հոսանքներ ոչ մեթիլացվածներից, որոնք կարող են ուղղակիորեն կարդալ հարթակի կողմից:Nanopore sequencing-ը հնարավորություն է տալիս ամբողջ գենոմի պրոֆիլավորումը 5mC և 6mA մեկ նուկլեոտիդային լուծաչափով:
Հղում
Ջուն Սոնե, և.ալ.Երկար ընթերցված հաջորդականությունը բացահայտում է GGC-ի կրկնվող ընդլայնումները NOTCH2NLC-ում՝ կապված նեյրոնային ներմիջուկային ներառման հիվանդության հետ:Բնության գենետիկա (2019)
Tech and Highlights նպատակ ունի կիսվել տարբեր հետազոտական ասպարեզներում տարբեր բարձր թողունակության հաջորդականության տեխնոլոգիաների վերջին հաջող կիրառմամբ, ինչպես նաև փորձարարական նախագծման և տվյալների արդյունահանման ոլորտում փայլուն գաղափարներով:
Հրապարակման ժամանակը՝ Հունվար-06-2022